イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1 変異体阻害剤イボシデニブに対する耐性は、代替二量体によって克服できる

Nature Communications volume 13、記事番号: 4785 (2022) この記事を引用

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イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1 (IDH1) R132C および R132H 変異体の阻害剤であるイボシデニブは、急性骨髄性白血病 (AML) の治療薬として承認されています。 IDH1 R132C/S280F につながる IDH1 R132C の 2 番目の部位変異によるイボシデニブに対する耐性が出現しました。 我々は、IDH1 R132C/S280F および R132H/S280F バリアントに関する生化学的、結晶学的、細胞的研究について説明します。これは、IDH1 二量体界面での阻害剤結合の調節と速度論的特性の変化の両方が関与する第 2 部位耐性のメカニズムについて情報を提供します。これにより、IDH1 R132C および IDH1 R132H と比較して、より効率的な 2-HG 生成が可能になります。 重要なことに、生化学的および細胞的結果は、現在第2相臨床試験中のいくつかを含む代替阻害剤を使用することによって、AML患者におけるS280F媒介耐性を克服できるはずであることを実証している。

がん細胞が代謝を変化させる可能性があることは以前から知られていました 1 が、この知識が治療効果に利用されるようになったのはつい最近のことです 1、2、3。 ヒトには 3 つのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ アイソフォーム (IDH1-3) があり、これらはイソクエン酸から 2-オキソグルタル酸 (2-OG) への変換を触媒します。 IDH1/2 は補因子として NADP+ を使用しますが、トリカルボン酸 (TCA) 回路の一部である IDH3 は NAD+4,5 を使用します。 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1 (IDH1) および 2 (IDH2) をコードする遺伝子に対するさまざまな体細胞変異により、2-OG から 2-ヒドロキシグルタル酸 (2-HG) への還元を触媒する能力が大幅に増加した変異体が生じます6,7,8,9。 したがって、2-HG レベルの上昇は、潜在的にクロマチンの不安定化を介して腫瘍形成を促進すると考えられています 10。 がん細胞で最も一般的な IDH1 バリアントは、R132H および R132C11 です。

複数の IDH1 阻害剤と IDH2 阻害剤が報告されていますが、臨床使用、つまりがん細胞が IDH 変異体を作る急性骨髄性白血病 (AML) の治療で承認されているのは、IDH1 阻害剤 (イボシデニブ) と IDH2 阻害剤 (エナシデニブ) の 1 つだけです。 しかし、イボシデニブ耐性は、IDH1 R132C/S280F を生成する第 2 部位変異の結果として出現しており、現在までに 5 例が報告されています 14、15、16。

2番目の部位IDH1 S280F置換がイボシデニブに対する耐性を可能にする正確な機構的根拠、およびイボシデニブを超えたIDH1変異体阻害へのその影響は不明である14、15、16。 これらの疑問に対処する、IDH1 R132C/S280F および IDH1 R132H/S280F に関する生化学的、構造的、細胞的研究を報告します。 単離された酵素を用いた結果は、二量体界面での阻害剤結合の減少および速度論的特性の変化を含む、S280F媒介耐性の機構を知らせ、IDH1 R132CまたはR132Hと比較して2-HG産生の増強を可能にする。 重要なのは、この結果は、S280F 置換がイボシデニブに対する耐性を引き起こすことを明らかにしていますが、他のいくつかの IDH1 R132H および R132C 阻害剤には当てはまらず、その一部は第 2 相臨床試験中です。

IDH1 S280F 媒介阻害剤耐性のメカニズムを調査するために、確立されたプロトコール 17,18 を使用して、高度に精製された形態の組換え IDH1 R132C/S280F および R132H/S280F、および比較のために IDH1 R132C、IDH1 R132H、IDH1 野生型 (wt)、IDH1 を作製しました。 S280F (IDH1 R132C または R132H なし) および IDH1 R132H/Q277E (補足図 1a)。 IDH1 R132H/Q277E 変異体は、IDH2 変異阻害剤エナシデニブに対する獲得薬剤耐性が (i) IDH2 R140Q/I319M および (ii) IDH2 R140Q/Q316E に関連付けられているために作成されました。 IDH2 I319 は IDH1 S280 と相同であり、IDH2 Q316 は IDH1 Q277 と相同です (補足図 1b/c)14。 IDH1 R132HおよびR132Cに関する以前の研究と一致して、すべての組換えタンパク質は溶液中で主に二量体であり（補足図1d〜f）、2つのNADPH分子と共精製される可能性があります（IDH1 wtおよびR132H18について報告され、IDH1 R132Cについて示されているように、補足）図1g/h）。 生物物理学的研究では、S280F置換は二次構造に影響を及ぼさないことが示されていますが（補足図1i）、この置換はIDH1 R132CおよびR132H変異体、ならびにIDH1 wtの熱力学的安定性を大幅に強化します（図1b;補足図1j）。 ）。 以降の本文では、特に明記されている場合を除き、言及されるすべての IDH バリアントは IDH1 ベースであることに注意してください。

IDH1 変異体は、イソクエン酸の酸化と 2-OG から 2-HG への還元を触媒しました。 b 非線形回帰曲線フィットからの IDH1 変異体 (400 nM) の速度論的パラメーター (平均の標準誤差、n = 3)。 条件: 100 mM Tris、10 mM MgCl2、0.2 mM DTT、0.005%v/v Tween 20、および 0.1 mg/mL BSA (pH 8.0)。 網掛け: 示差走査蛍光分析 (DSF、3 μM 酵素) または円二色性 (CD、0.2 mg/mL 酵素) によって測定された IDH1 バリアントの融解温度 (Tms)。 λ：215nm。 条件: DSF (20 mM トリス、100 mM NaCl、pH 7.4)。 CD (10 mM リン酸ナトリウム、pH 8.0)。 詳細については、補足情報を参照してください。 c 1H NMR（700 MHz;エラーバー：平均の標準誤差、n = 1H経時実験の独立した3回の反復）によって測定された、IDH1変異体によって触媒された2-OGからの2-HG形成。 条件: 500 nM 酵素、10 mM MgCl2、1.5 mM 2-OG、1.5 mM NADPH。 インキュベーション時間: 12 分。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 d NMRで測定した、IDH1変異体によって触媒されたイソクエン酸からの2-HG形成（700MHz、平均の標準誤差、1H時間経過実験のn = 3回の独立した反復）。 条件: 750 nM 酵素、10 mM MgCl2、3 mM DL-イソクエン酸、1.5 mM NADP+; インキュベーション時間: 9 分。 緩衝液: 50 mM Tris-d11、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、および 10% D2O、pH 7.5。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

1H NMRを使用して2-OGから2-HGへの還元とイソクエン酸から2-HGへの2段階の代謝回転を測定し、R132C/S280FおよびR132H/S280Fバリアントの触媒活性を分析しました（図1a/c/）。 d; 補足図 2a/b)。 イソクエン酸から 2-HG への変換に関与する 2 つの反応は全体的に酸化還元中性であるため、この変換は NADP+/NADPH 測定では容易に監視できません 18。 予想通り、NMRの結果は、D-イソクエン酸がR132C / S280FおよびR132H / S280Fの基質であることを示しています（補足図2c）。 特に、R132C/S280FおよびR132H/S280Fの両方が、それぞれR132CまたはR132Hより効率的にイソクエン酸から2-HGへの変換および2-OGから2-HGへの変換を触媒することを明らかにしている。 (図1c/d)

UV分光法によりNADPH消費をモニタリングするR132C / S280FおよびR132H / S280Fによる反応速度論分析（図1b）は、S280F置換により、2-OGから2-HGへの変換の触媒効率（kcat / KMで測定）が増加することを実証しました。類似の R132C および R132H バリアントに比べて、2-OG と Mg2+ の両方の KM 値が減少しました。 これらの変異体とは対照的に、主に二量体であり、研究された他のIDH変異体と比較して同様の二次構造を有するR132H / Q277E変異体（補足図1d〜f、i）は、1H NMRアッセイによって不活性でした（補足図1d〜f、i）。図2d/e）、R132Hよりも安定性が低くなります（補足図1j、図1b）。 触媒的に不活性な 2-OG 類似体 19,20 として N-オキサリルグリシン (NOG) とイソクエン酸塩 (10 mM Mg2+ を含む) を使用した示差走査蛍光分析 (DSF) 研究では、R132H/Q277E が少なくとも効率的に NOG またはイソクエン酸塩に結合しないことが示されています。 、おそらくその非活動性を反映しています（補足図2f）。

イソクエン酸から 2-OG への変換に関する S280F バリアント (R132C または R132H 置換なし) の NADP+ 消費を測定する動態解析 (補足表 1a) は、KM の減少の結果として、IDH1 wt と比較して効率 (kcat/KM) の増加を示しています。イソクエン酸塩。 Mg2+ の見かけの KM には変化はありませんでした。 ただし、IDH1 S280F バリアントでは、2-OG から 2-HG への変換で 2-OG と Mg2+ の KM 値（100 倍）が両方とも減少しました（補足表 1b）が、kcat は比較して 10 倍減少しました。 IDH1重量まで NADP+またはNADPHターンオーバーを通じて測定されたイソクエン酸と2-OGの変換の速度論的結果は、1H NMRターンオーバーアッセイとほぼ一致しています（補足図3a〜f）。 S280F 置換が基質と Mg2+ の両方の KM 値を低下させることを示す結果 (IDH1 S280F による触媒によるイソクエン酸から 2-OG への変換は別として) は、最近の研究で IDH1 バリアント阻害剤のアロステリックダイマー界面結合が示されているため、注目に値します。 Mg2+ と基質結合の両方を妨げます18。

S280F置換の機構的影響をさらに調査するために、サイクリックボルタンメトリーを使用してIDH1バリアントを研究しました（補足図3g-l）。これは、各NADP（H）サイクリング方向の速度を測定でき、イソクエン酸の2への変換を区別できます。 2-OG から 2-HG17 への還元からの -OG。 結果は、R132C および R132C/S280F が同様の効率でイソクエン酸の 2-OG への変換を触媒することを示唆しています (補足図 3g/h)。 ただし、イソクエン酸から 2-HG への全体的な変換効率は、R132C と比較して R132C/S280F で向上しており (図 1d)、2-OG から 2-HG への変換率は IDH1 R132C と比較して約 2 倍になっています (補足)図3g/h）。 サイクリックボルタンメトリーの結果は、R132H と比較して、R132H/S280F は、イソクエン酸から 2-OG への変換および 2-OG から 2-HG への変換の両方において、効率の向上（約 2 倍）を示すことを示しています（補足図 3i/j）。 IDH1 S280F（R132CまたはR132Hなし）は、イソクエン酸から2-OGへの変換に関して、IDH1 wtと比較して2倍増加した反応速度を示します（補足図3k/l）。

全体として、NADPH 吸光度、1H NMR 共鳴、またはサイクリック ボルタンメトリー パラメーターを測定する 3 つのターンオーバー アッセイでは異なる条件が使用されていますが、いずれも S280F 置換により、主にイソクエン酸から 2-HG への変換における R132C および R132H 変異体の効率が向上することが示されています。 2-OG から 2-HG への還元率。

これまでの研究では、おそらくイボシデニブを含むほとんどの IDH バリアント阻害剤 (IDH1 バリアントと複合体を形成したイボシデニブの結晶構造は報告されていません) が IDH1/IDH2 二量体界面で結合することが示されています 21,22,23,24,25,26。 我々は最近、阻害剤を介した Mg2+ 結合の破壊が、イソクエン酸から 2-OG18 への野生型反応と比較して、2-OG から 2-HG への変換に不均衡な影響を与える様式で起こることを示しました。 NOG およびイソクエン酸を使用した以前の結果と一致して、DSF 分析は、イソクエン酸および 2-OG の R132C、R132C / S280F、R132H、および R132H / S280F への効率的な結合には Mg2+ が必要であることを示唆しています（補足図 3m/n）。 S280F 置換により、少なくとも R132C/R132H 触媒による 2-OG から 2-HG への変換に関して、Mg2+ 結合の親和性が増加する可能性があります。

次に、イボシデニブによる単離されたR132C、R132C / S280F、R132H、R132H / S280Fの阻害を調査しました（図2a、補足図4a）。 NMR分析とMS分析はどちらも、S280F置換によりイボシデニブの結合効率が低下すること（図2b）、およびイボシデニブ結合の化学量論が二量体あたり1つの阻害剤分子であること（図2c）を示しています。 これらの観察は、ivosidenib18 による IDH1 wt および R132H 阻害に関する以前の研究と一致しています。 モデリング研究に基づいて、イボシデニブに対する耐性は、S280 をより立体的に要求の高いフェニルアラニン (S280F) に置換することによる阻害剤結合の阻害によって媒介され、さらにイボシデニブ結合は、 S28016 のアルコール側鎖に水素結合します。 耐性が立体障害によってのみ媒介されるのか、それとも S280 との水素結合の潜在的な損失に関連する要因を含む他の要因が関与するのかを調査するために、我々は R132C/S280A を製造しました。 イボシデニブは（少なくとも効率的に）R132C / S280FまたはR132H / S280Fを阻害しません（図2a）が、R132CのIC50 2.5 nMと比較して、R132C / S280AをIC50 992 nMで阻害します（補足図4b）。 この観察は、フェニルアラニン側鎖による立体障害と S280 への水素結合の喪失の両方がイボシデニブ耐性に寄与している可能性があることを示唆しています (R132C/S280A は R132C よりも強力に阻害されませんが、R132C/S280F は阻害されません) (図 2a) ; 補足図4b）。 この提案は、非変性 MS および CPMG NMR を用いた阻害剤結合研究 (図 2b) と一致しており、R132C と比較して R132C/S280A のイボシデニブに対する親和性が低下しているが、その低下は R132C/S280F でより顕著であることが示されています。 (図2b)。

a NADPH 吸光度アッセイによって測定された、イボシデニブ (10 μM) による IDH1 変異体 (400 nM) の阻害 (%)。 誤差: 平均値の標準誤差 (n = 3 つの独立した反復を同じ 96 ウェル プレートで測定)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 b KD は、非変性 MS (20 μM 酵素、技術的誤差: z = 19、20、21 の電荷状態に対して n = 3) および CPMG Project パルス NMR シーケンス (10 μM 酵素、n = 2) を使用して決定されました。 非変性 MS: クエン酸アンモニウム緩衝液 (200 mM、pH 7.5)。 CPMG NMR: 50 mM Tris-d11、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、および 10 % D2O、pH 7.5。 c IDH1 変異体に対するイボシデニブの結合を測定する非変性 MS 分析。 20 μM では、IDH1 変異体は主に 2 つの NADP(H) 分子が結合した二量体になります (破線)。 緑色の背景は、1 つのイボシデニブ分子の結合に対応します。 イボシデニブの最終濃度: 5 μM (4:1)、20 μM (1:1)、および 160 μM (1:8)。 コーン電圧: 100 V。

総合した結果は、S280F 置換がイボシデニブの結合を弱め、2-OG から 2-HG への変換を促進することを示しています。 注目すべきことに、第2部位のS280F置換も、少なくとも単一のR132CまたはR132H置換と比較した場合、阻害剤の非存在下でのイソクエン酸の2-HGへの変換を促進する(図1d)。 興味深いことに、IDH1 S280F（R132CまたはR132Hなし）は、IDH1 wtと比較して、イソクエン酸塩の2-OGへの代謝回転の触媒効率は増加しましたが、2-OGの2-HGへの還元については増加しませんでした（補足表1a / b;補足図。 3k/l)、イソクエン酸から 2-HG への全体的な変換の有効性の増加に関して 2 つの置換部位間の潜在的な協力性を示唆しています。 イソクエン酸塩と 2-OG の両方について、IDH1 S280F では基質結合 (KM によって判断) が増加しています (補足表 1a/b)。 2-OG から 2-HG への還元では、IDH1 S280F の Mg2+ の KM は IDH1 wt と比較して 100 倍減少しますが、イソクエン酸から 2-OG への変換では変化しません。 これらの観察結果を総合すると、S280F 置換は基質 (イソクエン酸または 2-OG) 結合を促進するが、Mg2+ 結合に対する効果は触媒される反応、つまりイソクエン酸から 2-OG、または 2-OG から 2-HG に依存することが示唆されます。 この結論は、基質と Mg2+ の IDH1 変異体への結合には、二量体界面の形成に関与するαヘリックス (α9 および α10) の移動を含む構造変化が関与することを示す最近の研究と一致しています。 IDH1 が半部位反応性を示すという証拠があることに注意してください 27。 注目すべきことに、イボシデニブおよび少なくとも他のいくつかのIDHバリアント阻害剤は、IDH1 wt（およびおそらくIDH2 wt）にも結合できますが、それらを効率的に阻害しません18。 これらの観察は、IDH1 二量体界面における立体配座動態の複雑さと、それらが活性部位の化学にどのように関連しているかを示しています。 Mg2+ や基質結合の潜在的な調節など、これらの微妙な機構の問題により、二量体界面部位でのアロステリックリガンド結合が阻害という観点からどのように現れるかを正確に予測することが困難になっています。 したがって、R132C / S280FおよびR132H / S280Fに対する報告された14種類のIDHバリアント阻害剤のセットを単離酵素でスクリーニングしました（補足図4a / c）。

重要なのは、阻害剤のうち7つはR132C / S280FまたはR132H / S280Fの阻害を示さなかったが（活性部位で結合すると報告されているSYC-435の1つを含む28）、スクリーニング結果（補足図4c）により、そのうちの7つは阻害剤は二重変異体、すなわち GSK321、GSK864、IDH224、IDH305、IDH556、FT-2102、および DS-1001B に対して活性を保持しました。 これらの阻害剤のいくつかは、高い効力（IC50 < 100 nM）、すなわち IDH224、FT-2102（R132H/S280F に対してのみ）、および DS-1001B を示します（図 3a）。 各阻害剤シリーズから強力な代表的な阻害剤をさらなる研究のために選択しました (つまり、GSK864、IDH224、FT-2102、DS-1001B)。 驚くべきことに、非変性MS研究は、これらすべての阻害剤が2分子の化学量論で各IDH1二量体に結合できることを示しました（図3b、補足図4d）。 この観察は、1 つの阻害剤分子のみが IDH1 二量体に結合することが観察されたイボシデニブの観察とは対照的であることに注意してください (図 2c)。 阻害剤結合親和性（非変性 MS によって測定）は、FT-2102 では変化しませんでしたが、一般に R132C/S280F および R132H/S280F ではそれぞれ R132C および R132H よりも低かった（図 3c）。 最も強力な R132C/S280F 阻害剤である DS-1001B も溶液アッセイ (CPMG NMR を使用) で分析され、R132H/S280F に対する親和性が最も低く (KD = 4.19 μM)、試験したすべての変異体に対して強固な結合を示すことが判明しました。 ）他のテストされたIDH1変異体と比較した（図3c）。

IDH1 バリアント (30 nM) での IC50 値 (平均の標準誤差、n = 3)。 ni = 阻害は観察されません。 条件: 100 mM Tris、10 mM MgCl2、0.2 mM DTT、0.005%v/v Tween 20、および 0.1 mg/mL BSA (pH 8.0)。 b 非変性 MS 分析。 破線: IDH1 二量体 (z = 20、2 つの NADP(H) 分子が結合)、緑色の陰影は 1 つの阻害剤分子の結合に対応し、ミントの陰影は 2 つの阻害剤分子の結合に対応します。 条件: 20 μM IDH1 バリアント、20 μM 阻害剤、コーン電圧: 100 V。 c 非変性 MS (20 μM 酵素、技術誤差: z = の場合は n = 3) によって測定された KD 測定 (平均の標準誤差)。 19、20、21 の電荷状態）および CPMG NMR（括弧内の値、10 μM 酵素、n = 2）。 非変性 MS: クエン酸アンモニウム緩衝液 (200 mM、pH 7.5)。 CPMG NMR: 50 mM Tris-d11、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、および 10% D2O、pH 7.5。

NADPH 吸光度アッセイを使用したターンオーバー アッセイは、R132C、R132C/S280F、R132H、および R132H/S280F 阻害が Mg2+ および 2-OG レベルに関して明らかに競合していることを示唆しています。 阻害剤の効力は、FT-2102 の場合を除き、NADPH 濃度の変動によって実質的に影響を受けませんでした（補足図 5a-c）。

阻害剤の結合に対する S280F 置換の影響をさらに調査するために、結晶学的情報の取得に取り組み、カルシウム、2-OG、および NADPH と複合体を形成した R132C/S280F の構造を取得しました（分解能 2.1 Å、空間群: C2221、3 分子（A –C）非対称ユニット内の（補足図6a）、PDB：7PJM;構造は、報告されたR132Hの構造を検索モデルとして使用して解決されました19;図4a–d）。

R132C/S280F の結晶構造から見たリボン図 (PDB: 7PJM、解像度 2.1 Å)。 非対称ユニットで観察されるように、鎖 A (小麦) と鎖 B (緑色) によって見かけの二量体が形成されます。 オレンジ色の丸: 2-OG、NADPH、およびカルシウムを含む活性部位。 L1ループ：バイオレット。 b 2-OG、NADPH、およびカルシウムを示すポルダー省略マップ (青いメッシュ、等高線 3.0 σ) の拡大図。 二量体界面を覆う L1 ループは紫色です。 黒丸：F280（シアン）を示すポルダー省略マップ（青色メッシュ、等高線：3.0σ）との二量体界面。 c 両方のモノマーにおける W124 (L1)、F280 (シアン、α10)、および W267 の間の疎水性相互作用を強調するダイマー界面の図。 d 金属結合部位の図。 カルシウム結合残基 D252 (モノマー 1、小麦、α9)、D275 および D279 (モノマー 2、緑色、α10) が示されています。 e 2つのNADPHおよび2つのDS-1001B（オレンジ）分子と複合体を形成したR132C/S280F（PDB：7PJN）、解像度2.45Å）の結晶構造からのリボンビュー。 この酵素は開いた不活性構造をとっている可能性があります。 非対称ユニットで観察されるように、見かけの二量体は鎖 B (小麦) と鎖 C (緑色) によって形成されます。 DS-1001B は二量体界面 (黒丸) で結合します。 f 二量体界面の DS-1001B および残基 F280 (シアン) を示す干拓地省略マップ (青いメッシュ、等高線: 3.0 σ)。 L1 ループ (紫) がダイマー インターフェイスをカバーしていることに注意してください。

報告されている IDH1 構造 19,29 との比較は、R132C/S280F 構造がおそらく閉じた活性部位の立体配座 (I76 と L250 の間の距離で測定される、鎖 A と B によって形成される見かけのホモ二量体における 2 つの活性部位の裂け目の幅) を反映している可能性があることを示唆しています。は活性部位の入り口にある残基であり29、12.6Åおよび13.0Åであり、閉じた立体構造を示しています29;補足図6b/c)。 この構造は、α10上に位置する2つのS280F残基のフェニル環が二量体界面で互いに隣接していることを明らかにしています（図4a/b）。 W124およびW267の側鎖とともに、S280Fのフェニル基は二量体界面で増加した疎水性領域を作成します（図4c）。これはおそらくS280Fバリアントの熱安定性の増加を反映しています（図1b、補足図1j）。 。

R132C / S280F 構造では、阻害剤結合ポケット 30 を部分的に覆う L1 ループ（図 4b、補足図 7a / b）が、カルシウム、2-OG、NADPH19。 L1 ループの立体構造の違いは（部分的に）結晶化条件の違いを反映している可能性がありますが、この観察は IDH1 の触媒作用および阻害時の立体構造運動の重要性を裏付けています。 さらに、R132H19を含む他の構造で観察されるものと比較して、R132C / S280F構造の金属結合残基Asp-252（図4d、補足図7c / d）の立体構造には違いがあります。 ただし、カルシウムイオンによるキレート化を含む2-OG結合の全体的な性質は、異なる構造でも変化しません（補足図7d）。

NADPHとその強力な阻害剤DS-1001Bと複合体を形成したR132C / S280Fの結晶構造を得ました（解像度2.45Å、空間群：P21212、非対称ユニット内の4つの分子（A〜D）（補足図8a）、PDB：7PJN） ; 構造は、報告されている R132H の阻害剤結合構造を検索モデルとして使用して解析されました 31; 図 4e/f)。 非変性 MS の結果 (図 3b) と一致して、この構造は 2 つの DS-1001B 分子が二量体界面で結合していることを示しています (図 4e)。 興味深いことに、2つのDS-1001B分子は、トリクロロフェニル環が隣接するような方法で結合します。これは、阻害剤結合の改善を目的とした将来の医薬化学の取り組みに関して興味深い観察です（図4f）。 DS-1001B 複合構造は、オープンまたはセミオープン (不活性) 構造を反映している可能性があります。I76 と L250 の間の距離で測定した、鎖 B と鎖 C によって形成される見かけのホモ二量体の 2 つの活性部位の裂け目の幅は 17.7 Å です。 （セミオープン）および20.2Å（オープン、補足図8b / c）。 不活性構造について以前に報告されたように 23、両方のモノマーのα10は部分的に無秩序であり、部分的なループ構造をとります（補足図9）。これは阻害剤の結合に対応するのに役立つ可能性があります。 特に、阻害剤のないR132C / S280Fの構造とは対照的に、DS-1001B複合体構造では、2つのモノマーのS280F残基は隣接していませんが、14.9Å離れています（最も近いC原子、補足図10）。

溶液研究と一致して、異なる条件下で得られた結晶構造の違いを拡大解釈しないように注意する必要がありますが、我々の結晶学的結果は、S280F 置換がイボシデニブが結合する可能性が高い二量体界面の化学に影響を及ぼし、潜在的な可能性があることを示しています。金属イオン結合、そしてその結果としての基質結合を含む活性部位の化学に影響を与える。 他の構造や最近の反応速度論的研究や他の生物物理学的研究 18,27 と組み合わせると、これらの生物物理学的結果は、IDH (バリアント) 触媒における立体構造動態と複雑さの役割をさらに強調します。 これらの正確な性質とその阻害効果を定義することは困難であり、モデル化と組み合わせた個々の代謝回転に関する構造研究が必要です。 したがって、耐性との戦いを含むIDH変異体の阻害は、初期段階での細胞研究に関連したさまざまな種類の代謝回転および結合アッセイを使用する経験に基づいたアプローチによって主に追求されるべきであると我々は提案する。

このアプローチの裏付けは、選択された 5 つの (潜在的な) R132C/S280F 阻害剤、すなわちイボシデニブ、GSK864、IDH224、FT-2102、および DS-1001B に関する細胞研究の結果から得られます (図 5)。 補足図11で報告されているように、LN-18神経膠芽腫細胞株（ATTC CRL-2610）を使用して、組換えIDH1バリアント（R132C、R132C / S280F、R132H、R132H / S280F）を作製しました。

LN18 細胞を、DMSO 中の阻害剤イボシデニブ、GSK864、FT-2102、IDH224、および DS-1001B で処理しました (最終濃度: 5 μM)。 2-HG レベルは、MS51 と組み合わせた陰イオン交換クロマトグラフィーによって測定されました (誤差: 平均の標準誤差、n = 4 の独立した反復)。 イボシデニブは、R132C/S280F および R132H/S280F 担持細胞の 2-HG レベルを低下させる活性がないか、活性が低い一方、他の阻害剤は 2-HG レベルを低下させる活性があることに注意してください。 対照細胞は、IDH1を含まないレンチウイルスベクターによる形質導入によって生成された。 箱ひげ図: 中心線は中央値、境界は 25 パーセンタイル値と 75 パーセンタイル値です。 ひげは、各実験グループで測定された最小および最大の 2-HG レベルです。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

予想通り、IDH1変異体を発現しない対照細胞では、内因性2-HGの存在レベルが低いため、阻害剤は誤差の範囲内で検出可能な効果を示さなかった(図5)。 報告された結果 24、26、32 と一致して、すべての阻害剤は、R132C および R132H を過剰産生する細胞における 2-HG の産生を効率的に抑制しました。 対照的に、R132C/S280F または R132H/S280F を過剰産生する細胞に対する 5 つの阻害剤の効果は異なりました。 S280F 置換がイボシデニブに対する耐性を引き起こすことを示す生化学データおよび以前の臨床結果 14、15、16 と一致して、イボシデニブは R132C/S280F および R132H/S280F 過剰産生細胞における 2-HG 産生の抑制には効果がありませんでした (図 5)。 R132C/S280F 過剰産生細胞では、GSK864 は 2-HG レベルの低下において中程度の効力しかありませんでしたが、IDH224、DS-1001B、および FT-2102 は 2-HG レベルの低下においてより強力でした。 興味深いことに、FT-2102 は、単離された R132C/S280F に対して IDH224 および DS-1001B よりも相対的に効力が弱かった (図 3a; IC50 1.3 μM)。 細胞における FT-2102 の比較的高い効力は、IDH224 や DS-1001B と比較して細胞透過性が向上していることを反映している可能性があります。

R132H/S280F (図 5) の場合、イボシデニブ、GSK864、IDH224、および FT-2102 処理の結果は、R132C/S280F 担持細胞の結果と類似していました。 しかし、驚くべきことに、DS-1001B は、この細胞状況において R132H/S280F の阻害剤としては比較的不十分でした。 この差は、少なくとも部分的には、他の試験されたIDH1変異体の値と比較して、DS-1001Bと単離されたR132H/S280FのIC50が高いことを反映していると考えられます（図3a）。

上述したように、阻害剤の相対的な効率には差がありますが、細胞の結果は単離された IDH1 変異体の結果とよく相関しています。 最も重要なことは、臨床第 2 相試験中の FT-2102 や DS-1001B などの特定の阻害剤 33,34,35 が、R132C/S280F 担持細胞の 2-HG レベルを低下させるのに有効であることを明らかにしたことです。

IDH バリアント阻害剤の開発は、小分子薬剤によって代謝をうまく標的化できる先駆的な例であるため、がん治療における画期的な進歩です。 しかし、予想通り、特に二量体界面での S280F 置換を介して、先駆的薬剤であるイボシデニブに対して耐性が出現しました 14、15、16。 単離されたIDH1変異体を用いた阻害剤スクリーニング結果から、R132C/S280F変異体もR132H/S280F変異体もイボシデニブによって（効率的に）阻害されないことが明らかになった。 しかし重要なことに、この結果は、現在開発中の報告された IDH バリアント阻害剤のすべてではなく一部にも当てはまります。 したがって、適切な医薬化学プログラムによって、二量体界面変異体によって引き起こされるIDH変異体阻害剤耐性を克服することが可能であるはずである。

生化学的結果と構造的結果を組み合わせた結果、S280F置換は、部分的にはIDH1二量体界面への結合を阻害することによって、部分的にはR132CおよびR132H変異体の効率を高めることによって、R132C/S280FまたはR132H/S280Fを産生する癌細胞におけるイボシデニブに対する耐性を可能にすることを示している。イソクエン酸および/または 2-OG から 2-HG への変換の触媒において。 ここや他の場所で報告された研究 18 は、二量体界面での IDH バリアント阻害剤のアロステリック結合が、2-OG から 2-HG への変換を不均衡に阻害する形で活性部位 Mg2+ (またはイソクエン酸の場合は Mg2+-基質複合体) 結合に影響を与えることを示唆しています。イソクエン酸から 2-OG への変換と比較。 これらの観察の正確な分子的理由は、IDH1 wt 触媒作用の詳細とともに、将来の時間分解生物物理学的研究の主題となるはずです。

in vitro で観察された R132C S280F の触媒効率の増加と in vivo のがんとの関連性は不明ですが、IDH バリアント阻害剤の存在下で上昇した 2-HG レベルを維持するのに役立つ可能性があります。 もしそうであれば、成熟癌細胞における 2-HG の機能的役割をサポートし、その結果、2-HG レベルの低下をもたらす阻害剤ベースの治療をサポートします。 成熟癌細胞における 2-HG の役割は異なる可能性があること、または腫瘍形成における 2-HG レベルの上昇の提案されている役割に追加される可能性があることに注意してください 36,37。

アロステリック結合によるIDH1変異体阻害の機構は複雑であるにもかかわらず、我々の結果は、R132C/S280Fを介したイボシデニブ耐性は、他の阻害剤、例えばIDH224、FT-2102、DS-1001B、およびおそらくこれらの改良された変異体を使用することによって克服できることを明らかに示している。 。 イボシデニブと同様に、これらの阻害剤も二量体界面で結合します。 しかし、IDH1変異体二量体あたり1つの阻害剤分子の化学量論で結合するイボシデニブとは異なり、強力なR132C/S280F阻害剤（生化学的および細胞研究で示される）は、非変性によって示されるように、二量体あたり2つの阻害剤分子の化学量論で結合します。阻害剤を使用した場合と使用しない場合の R132C/S280F の MS 研究および結晶学的分析。 重要なのは、R132C/S280F と R132H/S280F の 2 つの阻害剤、FT-2102 と DS-1001B がすでに第 2 相臨床試験に入っていることです 33,34,35。 したがって、耐性が出現したときに、ある IDH 変異阻害剤を別の IDH 変異阻害剤に置き換えることを含む効率的な治療計画を開発する可能性があります。 特に、最初の治療前に発生するであろう耐性の種類を予測できる場合には、阻害剤を組み合わせて使用​​する可能性もあります。

IDH1 とその変異体の機構、および報告されている IDH 変異体阻害剤の作用機序に関する最近の研究 18 では、アロステリック阻害剤が部分的には使用されたスクリーニング条件の結果として優先的に同定された、つまりスクリーニングが実施されていないことが示唆されています。さまざまな Mg2+ 濃度。 S280F の性質が R132C/S280F に対するイボシデニブ耐性を可能にしたことは、二量体界面へのアロステリック結合によって作用しないものを含む、新しいタイプの IDH 阻害剤の開発が興味深いことを示唆しています。 触媒作用中の微妙な構造変化に関与するIDH二量体界面での阻害剤の結合は、活性部位での結合および/またはNADPHと競合する阻害剤と比較して、特に耐性になりやすい可能性があります。 ただし、S280F 置換により、IDH1 活性部位に結合すると報告されている阻害剤 SYC-435 に対する耐性が付与されることに注意する必要があります 28。

現段階では入手可能な臨床データが限られているため、IDH バリアント阻害剤に対する耐性がどのように出現するかを予測することは困難です。 したがって、二量体界面で結合する現在有効な阻害剤の最適化と併せて、アロステリック結合を含まない機構を介して作用するIDHバリアント阻害剤の開発には価値があると我々は示唆する。 我々の結果はまた、将来の医薬化学の取り組みでは、単離された形態（異なるアッセイ条件下）での耐性を可能にする変異を含む複数のIDH1/2変異体、ならびに実験に基づいた細胞および生体内分析を最適に採用する必要があることを示唆している。

異なる突然変異を導入するためのフォワードプライマーとリバースプライマーは、報告されている手順に従って設計されました38。 pET22bプラスミド(Sigma-Aldrich)を鋳型として使用した。 IDH1 R132H/S280F および R132C は、IDH1 R132H DNA テンプレート (記載どおりに取得) から作成しました 18。 IDH1 R132C/S280F および R132C/S280A は、R132C DNA テンプレートから作成されました。 IDH1 S280F は、IDH1 wt DNA テンプレートから作成されました。 反応は、Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)、デオキシヌクレオチド溶液混合物 (New England Biolabs)、および GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) を使用して実施しました (2 ステップ法)。 製造業者のプロトコールに従って、GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific) を使用して、混合物を精製しました。 鋳型 DNA を Dpn1 (New England Biolabs; 3 時間インキュベーション、37 °C) を使用して消化しました。 生成物をXL10-goldセル(Agilent)に形質転換した。 コロニーを10 mLの2TY培地で一晩増殖させ、GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific)を使用してプラスミドを抽出しました。 プラスミドはMilliQ精製水で溶出されました。 配列は、Eurofins Scientific によって実施されたサンガー配列決定によって確認されました。

組換えタンパク質の生産は、記載されているように実施されました17、18。 簡単に説明すると、組換えタンパク質は、1 mM イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) を使用し、誘導後温度 20 °C で BL21(DE3)plysS E.coli 細胞内で生成されました。 細胞を遠心分離によって回収し、超音波処理によって溶解した。 細胞溶解物を 5 mL HisTrap HP カラム (Cytiva) にロードし、イミダゾール段階勾配 (最大 500 mM) で溶出しました。 所望のタンパク質を含む画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、３００ｍＬ）を使用して定組成溶出によりさらに精製した。 画分の純度は、SDS PAGE ゲル電気泳動を使用して評価されました (補足図 1a)。 タンパク質濃度は、Nanodrop One マシン (Thermo Scientific) を使用して測定され、IDH1 モノマー濃度に対応します。

結晶学的研究のために、IDH1 R132C/S280F を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製しました。 5 mL HisTrap HP カラム (Cytiva) を使用した最初の精製後、目的のタンパク質を含む画分を PD-10 カラム (Merck) を使用した緩衝液交換に供し、Cytiva Q Sepharose Fast Flow カラムにロードしました。 タンパク質をNaCl勾配(最大1M)で溶出し、その後、ゲル濾過精製(Superdex S200カラム(GE Healthcare、300mL)、20mM Trisおよび100mM NaCl(pH7.4)を含む緩衝液を使用する定組成溶出)に供した。

電気化学実験のために、Chlamydomonas reinhardtii 由来のフェレドキシン NADP+ レダクターゼ (FNR) を記載どおりに生成しました 39。 簡単に説明すると、1 mM IPTG を添加することによって BL21(DE3)plysS E. coli 細胞で組換え FNR を生成し、培養物をさらに 4 時間 (37 °C) 増殖させました。 細胞は遠心分離によって回収されました。 ペレットを少量の冷緩衝液（50 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM DTT; pH 7.4）に再懸濁し、-80 °Cで一晩保存しました。 細胞を解凍し、フレンチプレスを20 psiで使用して溶解し、溶解物を超遠心機(Beckman L8-70M Ultracentrifuge)を使用して4℃で遠心分離しました。 Ni2+ HisTrap HPアフィニティカラム(GE Healthcare Life Sciences)を使用してFNRを上清から単離し、イミダゾール勾配(最終濃度250mMイミダゾール)を使用してカラムから溶出した。 280 nm および 460 nm での吸光度に基づいて、FNR を含む画分を選択しました。 ＦＮＲを含む画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ｍＬ遠心フィルター（１０ｋＤａ）を使用して最終体積約２ｍＬまで濃縮した。 次いで、濃縮されたＦＮＲ溶液を脱塩カラム（ＰＤ－１０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して、イミダゾールを除去した。 酵素は使い捨てのアリコートに分割され、液体窒素中で急速冷凍され、-80 °C で保存されました。

酵素動態は、340 nm (ε = 6220 M–1 cm–1) での吸収によって測定された NADPH 濃度の変化に基づいて、分光測光的に決定されました。 分析は、PHERAstar FS Microplate Reader を使用して、96 ウェルのハーフエリア透明マイクロタイター プレート (Greiner Bio-One 675001) で 25 °C、反応容量 100 μL で実施しました。 このアッセイは、定常状態の反応速度論と IDH1 変異体によって触媒される反応の阻害を研究するために使用されました。 アッセイ緩​​衝液は、100 mM Tris、10 mM MgCl2、0.2 mM ジチオスレイトール (DTT)、0.005%(v/v) Tween 20、および 0.1 mg mL-1 ウシ血清アルブミン (BSA) (pH 8.0) でした。 阻害アッセイでは、基質の添加によって反応を開始する前に、IDH1 変異体を阻害剤とともに 12 分間インキュベートしました。 標準誤差は、GraphPad Prism v9 を使用したカーブ フィッティングから導出されました。 特定の速度論的アッセイの詳細については、図の凡例を参照してください（図1〜3、補足図5、補足表1）。

2-オキソグルタル酸 (2-OG) 二ナトリウム塩、NADPH 四ナトリウム塩 (約 98%)、NADP+ 二ナトリウム塩、D-イソクエン酸カリウム塩、および MgCl2 × 6 H2O は Sigma-Aldrich から入手しました。 DL-イソクエン酸三ナトリウム塩はChemCruzから入手した。 阻害剤は、MedChemExpress、BioVision、DC Chemicals、Sigma-Aldrich、Enzo Life Sciences、Cambridge Bioscience Ltd から入手しました。GSK321 および GSK864 は、GSK のご厚意により提供されました。 ストック溶液はDMSO (10 mM)で調製しました。

メーカーのプロトコールに従って、Micro Bio-Spin 6 カラム (Bio-Rad) を使用して、IDH1 変異体を NMR バッファー (50 mM Tris-d11、100 mM NaCl、10% D2O、pH 7.5) にバッファー交換しました。 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、逆５ｍｍ ＴＣＩ １Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ凍結プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ７００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を使用して得た。 代謝回転アッセイのために MgCl2 (10 mM)、イソクエン酸/2-OG および NADP+/NADPH を添加し、1H NMR を使用して代謝回転をモニタリングしました (NS: 16、緩和遅延: 2 秒)。 水信号は励起彫刻によって抑制されました。 データは Mestrenova を使用して分析されました。

IDH1 変異体を NMR バッファー (50 mM Tris-d11、100 mM NaCl、10% D2O、pH 7.5) にバッファー交換し、メーカーのプロトコールに従って Amicon Ultra Centrifugal Filters (0.5 mL、カットオフ: 50 kDa) を使用して濃縮しました。 実験は 10 μM 阻害剤 (10 mM d6-DMSO ストックから) を使用して実施されました。 IDH1 変異体をこの溶液に滴定し、PROJECT-CPMG シーケンスを適用しました 40。 実験パラメータは次のとおりです。合計エコー時間、40 ミリ秒。 緩和遅延、2 秒。 水分の抑制は事前飽和によって達成されました。 タンパク質-阻害剤複合体の割合 ([PL]/([P] + [PL]) を阻害剤濃度に対してプロットしました。データは Mestrenova を使用して分析し、解離定数は GraphPad Prism (バージョン 9) による非線形回帰を使用して計算しました。 ）。

メーカーのプロトコールに従って、Micro Bio-Spin 6 Columns (Bio-Rad) を使用して、IDH1 変異体をリン酸ナトリウム緩衝液 (10 mM、pH 8.0) に緩衝液交換した。 ＣＤ測定は、ペルチェ温度制御セルホルダーを備えたＣｈｉｒａｓｃａｎ ＣＤ分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を使用した。 スペクトルは 260 ～ 185 nm の範囲 (0.5 nm 間隔) で記録されました。 測定は 23 °C で 3 回行い、サンプルのバックグラウンドからバックグラウンドを差し引きました。 スペクトルは、Savitzky-Golay フィルター (ウィンドウ サイズ 4) を使用して平均化され、平滑化されました。 データはタンパク質濃度（NanoDrop One マシンを使用して測定）に対して正規化され、平均残基楕円率は次の式に従って計算されました。 1]:

IDH1 変異体の熱安定性を分析するために、波長を 215 nm に固定し、温度を 10 °C から 80 °C まで徐々に上昇させました。 加熱速度は 1 °C min-1 で、CD シグナルは 2 °C (±0.4 °C) ごとに測定されました。 スペクトルは、GraphPad Prism (バージョン 9) の Savitzky-Golay フィルター (4 次多項式、12 近傍) を使用して平滑化されました。 融解温度は、Graph Pad Prism (バージョン 9) を備えたボルツマン シグモイド モデルを使用して計算されました。 標準誤差は、ボルツマン シグモイド モデルを使用した曲線フィッティングから導出されました。

測定は、3 μM タンパク質および 3 × Sypro Orange を含む Tris 緩衝液 (50 mM、pH 7.4) 中で、Bio-Rad Thermal Cycle CFX96 で実施されました。 加熱速度は 20 ～ 95 °C の範囲で +0.2 °C/s でした。 データは Bio-Rad CFX Manager 3.1 を使用して分析されました。 標準誤差は 3 つの独立した反復から得られました。

Novex™ WedgeWell™ 4 ～ 12% トリスグリシンゲルを使用しました。 ゲルチャンバー (Invitrogen) を氷浴で冷却し、ゲル電気泳動は NativePAGE ランニングバッファー (Invitrogen) を使用してコールドルーム (4 °C) で実施しました。 ゲル電気泳動を160 Vで1.5時間実施し、InstantBlue Coomassie (Expedeon)を使用してゲルを染色した。

SEC-MALS 測定は、LC-20AD ポンプ、SIL-20A オートサンプラー、SPD20A UV/Vis 検出器で構成される島津 HPLC システムに接続された Wyatt Dawn HELEOS-II 8 角度光散乱検出器と Wyatt Optilab rEX 屈折率モニターを使用して実施されました。 サンプルは、Superdex 200 HR10/30 カラムを使用し、流速 0.5 ml min-1 で分析しました。 サンプル濃度は、Tris (20 mM、pH 7.4) および NaCl (100 mM) を含む緩衝液中で 1 mg mL-1 でした。

電気化学実験は、窒素雰囲気 (O2 < 1 ppm) を含む嫌気性グローブボックス (Glove Box Technology) 内で実行されました。 電気化学装置 (ガラス電気化学セルおよび回転熱分解グラファイト エッジ (PGE) 電極) は以前に報告されたとおりです 17。 Nova ソフトウェアを使用した Autolab PGSTAT 10 ポテンショスタットを使用して、電気化学実験を実施しました。 電極電位 (E) は飽和カロメル電極 (SCE) に対して測定され、温度依存の電位変換式を使用して標準水素電極 (SHE) に変換されました (25 °C での変換は次のとおりです: ESHE = ESCE + 0.241 V)17 。 対極は白金線であった。 ナノ多孔質酸化インジウムスズ (ITO) 電極は、ITO ナノ粒子 (<50 nm、Sigma-Aldrich) を熱分解グラファイトエッジ電極 (ITO/PGE) 上に電気泳動堆積することによって作成されました17。 4 ～ 6 µL の混合酵素溶液を ITO 電極上にドロップキャストし、溶液が蒸発しないようにしながら室温で少なくとも 30 分間インキュベートすることにより、酵素を電極にロードしました。 すべての場合において、0.85 nmol (ホモ二量体ベース) の IDH1 (野生型およびすべての変異体) を使用しました。 同時にロードされるFNRの量は、所望の最終酵素比を達成するように調整されました。 試験したすべての新形態性 IDH1 バリアント (R132C、R132C/S280F、R132H、R132H/S280F) は、FNR と 2.5 対 1 のモル比でロードされました (つまり、FNR に対して 2.5 倍以上 (ホモ二量体モル当量) の各 IDH1 バリアントがロードされました。それぞれの実験）。 対照的に、IDH1 wt および IDH1 S280F は、新形態性 IDH1 変異体よりもはるかに速い速度で DL-イソクエン酸を酸化するこれらの IDH1 酵素により、システムが FNR 制限を受けないようにするために、FNR と 1 対 8 のモル比でロードされました。 IDH1 濃度はホモ二量体に基づいて計算されました。 酵素がロードされた電極は、溶液中に遊離酵素が存在しないことを確認するために、実験ごとに反応緩衝液に浸す前に緩衝液を使用して徹底的にすすがれました。

メーカーのプロトコールに従って、Micro Bio-Spin 6 Columns (Bio-Rad) を使用して、IDH1 変異体を非変性 MS バッファー (酢酸アンモニウム、200 mM、pH 7.5) にバッファー交換しました。 非変性 MS 実験は、四重極 TOF (Waters Synapt G2Si) 装置と Advion Triversa Nanomate チップベースの ESI オートサンプラーを使用して実行されました。 阻害剤を MeOH に溶解し、タンパク質溶液に添加しました (最終タンパク質濃度: 20 μM)。 1.7 ～ 1.8 kV のスプレー電圧 (スプレー バッキング ガス圧力 0.6 psi、入口圧力 3.7 mbar) を適用しました。 サンプルコーンの電圧は 100 V と 5.2 V でした。スペクトルは、センタリングとスムージングを含め、Mass Lynx (バージョン 4.1) を使用して分析されました。 タンパク質-阻害剤複合体のパーセンテージ ([PL]/([P] + [PL]) を阻害剤濃度に対してプロットしました。ベースライン補正を適用し、GraphPad Prism (バージョン 9) による非線形回帰を使用して解離定数を計算しました。 ）。

IDH1 R132C/S280F (20 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.4中25.62 mg mL-1) を、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用した結晶化に使用しました。 シッティングドロップセットアップでは、250 μL のリザーバー溶液を備えた 24 ウェル Cryschem Plate (Hampton Research, USA) を使用しました 19。 PEG 濃度 (PEG3350 15 ～ 20%、横軸は 1% 刻み)、塩濃度 (酢酸カルシウム 200 または 225 mM、縦軸、それぞれシードありまたはシードなし) および Bis-Tris (0.1 M) を変化させたスクリーニングｐＨ７での実験を行った。 酵素 (25 μL) を 10 mM NADPH (水中、10 μL)、20 mM CaCl2 (水中、5 μL)、および 200 mM 2-OG (水中、10 μL) とともに氷上で 1 時間インキュベートして、最終タンパク質濃度は 12.81 mg mL-1 でした。 結晶化は、2 μL のタンパク質含有溶液を 2 μL の沈殿剤溶液に添加することによって達成されました。 プレートは StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab、ドイツ) でシールされました。 結晶（平均サイズ 100 μM）は 14 日以内に現れました。 再現性よく結晶を得るために、SeadBeat キット (Hampton Research, USA) を製造業者のプロトコールに従って使用し、結晶を粉砕しながら種まきを行った。 液滴を含む結晶は、グリセロール (25%(v/v)) を含むリザーバー溶液と 1:1 の比率で混合することによって凍結保護され、ナイロンループで収集され、液体 N2 中で凍結冷却されました。 結晶は、データ収集が必要になるまで液体 N2 中で保管されました。

データは、ダイヤモンド光源 (DLS) ビームライン I24 を使用して 100 K で収集されました。 データは、ビームライン自動処理パイプラインの Xia241 戦略を使用してインデックス付け、統合、およびスケーリングされました (補足表 4)。 IDH1 R132C/S280F の結晶構造は、PHENIX43 の AutoMR (PHASER42) サブルーチンを使用した分子置換 (MR) によって決定されました。 MR に使用した探索モデルは IDH1 R132H (PDB: 4KZO19) に基づいていました。 構造モデルは、COOT44 での手動再構築と Phenix.refine45 での結晶学的改良の反復サイクルによって最適化されました (改良の詳細は補足表 4 にまとめられています)。

IDH1 R132C/S280F (20 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)、pH 7.4中25.62 mg mL-1) を結晶化に使用しました。 シッティングドロップセットアップでは、報告されているように、250 μL のリザーバー溶液を備えた 24 ウェル Cryschem Plate (Hampton Research, USA) を使用しました 25。 クエン酸アンモニウム濃度（pH 7.0、0.75 ～ 2 M、横軸は 0.25 M ステップ）および DTT 濃度（1.5 ～ 3 mM、縦軸は 0.5 mM ステップ）を変化させたスクリーニングを実行しました。 タンパク質 (12.5 μL) を、NADPH (10 mM; 20 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM TCEP、pH 7.4 を含む緩衝液中、5 μL)、緩衝液 (6.8 μL)、および 10 mM とともに氷上で 1 時間インキュベートしました。 −１倍過剰のＤＳ−１００１Ｂ（ＤＭＳＯ中、０．７μＬ）を最終タンパク質濃度１２．８１ｍｇ ｍＬ−１まで添加した。 次に、この溶液 2 μL を 2 μL の沈殿剤溶液に加えました。 座っているドロッププレートを StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab、ドイツ) でシールすると、1 日後に結晶が現れました。 結晶の採取は、上記のように凍結保護剤としてグリセロールを使用して実施した。

データは、DLS ビームライン I03 でシンクロトロン放射線を使用して 100 K で収集されました。 データは、ビームライン自動処理パイプラインの Xia241 戦略を使用してインデックス付け、統合、およびスケーリングされました (補足表 4)。 初期の MR ソリューションは、IDH1 R132H (PDB: 5TQH31) の阻害剤結合構造を使用して取得されました。 PHENIX AutoBuild45、46、47、48、49 を使用して、この MR ソリューションから開始モデルを再構築しました。 構造モデルは、COOT44 での手動再構築と Phenix.refine45 を使用した改良の反復サイクルによって最適化されました (詳細は補足表 4 にまとめられています)。 解像度が限られているため (2.45 Å)、NCS 拘束が全体にわたって使用され、B 因子の TLS 精製が行われました (4 つのチェーンに対して 16 個の TLS グループ)。

ヒト神経膠芽腫 LN18 細胞は ATCC から入手し、供給者の指示に従って培養しました。 LN18 細胞は、レンチウイルス ベクター形質導入を使用して、IDH1 R132H、IDH1 R132C、IDH1 R132H/S280F、または IDH1 R132C/S280F をコードする導入遺伝子を過剰発現するように遺伝的に改変されました。 まず、レンチウイルス導入ベクター pCC.sin.36.IDH1R132H.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet および pCC.sin.36.IDH1R132C.PPTWpre を使用して、IDH1 の IDH1 S280F 変異配列を組換え PCR ベースのアプローチによって生成しました。 .CMV.tTA-S2tet50、鋳型としてIDH1のR132HおよびR132C配列を含む。 この反応では、Primer1_forward および Primer1_reverse (補足表 2) を使用しました。 続いて、IDH1 S280F 変異体アンプリコンを、BamH1-HF および Nhe1-HF を使用して同じ転移ベクターにサブクローニングしました。 続いて、IDH1 R132H、R132C、IDH1 R132H/S280F、または IDH1 R132C/S280F 配列を、Primer2_forward および Primer2_reverse (補足表 2) を使用した PCR 反応で増幅し、Xma1 および NheI- を使用して pUltra-Chili ベクター (AddGene) にクローニングしました。 HF。 制限酵素はNew England Biolabsから入手した。 すべての細菌の形質転換は、メーカーの指示に従って、XL10-Gold ウルトラコンピテントセルを使用して実行されました。 すべての構築物は、Primer3_forward および Primer3_reverse を使用したサンガー シーケンスによって検証されました (補足表 2)。

すべての IDH1 変異体 pUltra-Chili トランスファー プラスミドは、3 つのパッケージング プラスミド: pVSVg、pREV、および pMDL とともに HEK293T 細胞の一過性トランスフェクションによってレンチウイルス ベクター (LV) にパッケージ化されました。 HEK293T細胞は、10％FBS（Fisher Scientific、11550356）および5％ペンストレプト抗生物質（Sigma、P4458）を補充したIMDM（Sigma、I3390）中で培養した。 トランスフェクションの 48 時間後、HEK293T 馴化培地を回収し、遠心分離し、0.22 μm フィルターを使用して濾過しました。 ウイルスｐ２４抗原濃度は、ＨＩＶ－１ ｐ２４コアプロファイル酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｐ２４ラピッドタイターキットを製造業者の指示に従って使用して測定した。 新たに採取した馴化培地の段階希釈を使用して、ポリブレン（8μg ml-1）の存在下で6ウェルプレート内の1.2×105個のLN18細胞を感染させました。 対照として、細胞に、TdTomato を含むが IDH1 配列を含まない pUltra-Chili レンチウイルス ベクターを形質導入しました。

RNAは、RNeasy Micro Kit (Qiagen)を製造業者の指示に従って使用して抽出した。 必要に応じて、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) を使用して相補的 DNA を逆転写しました。 IDH1 TaqMan プローブ (Life Technologies) および TaqMan Fast Universal PCR Master-Mix (Applied Biosystems) を使用して、qPCR を使用して、コントロールおよび LV 形質導入細胞における IDH1 発現を測定しました。 反応は、QuantStudio™ 5 Dx Real-Time PCR System (Applied Biosystems) を使用し、GAPDH を内因性コントロール (Life Technologies) として使用して実行しました。 各標的遺伝子の発現は、相対定量化アプローチ (2 − ΔΔCT 法) を使用して評価されました。

液体の滅菌濾過ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、米国以外由来のウシ胎児血清（FBS）、およびL-グルタミンを含まない4500 mg L-1グルコースと重炭酸ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用しました。メルクライフサイエンス社から。 GlutaMAXTM サプリメントは Thermo Fisher Scientific から提供されました。 分子生物学用のジメチルスルホキシド (DMSO) は Merck から入手しました。 滅菌シリンジフィルター (直径 15 mm、細孔 0.2 μM、RC 膜) は Corning 製でした。 阻害剤を 5 mM 濃度まで DMSO に溶解し、Corning® シリンジ フィルター (再生セルロース、直径 18 mm、細孔 0.2 μm) で使用前に濾過しました。

空のベクターを含む、または組換え IDH1 R132C、IDH1 R132C/S280F、IDH1 R132H、または IDH1 R132H/S280F を産生する LN18 細胞を 37 °C および 5% CO2 でインキュベートし、10 % (v/v) FBS および 1% (v/v) GlutaMAXTM。 細胞を12ウェルプレートに200,000細胞mL-1でウェルあたり0.7mLで播種しました。 24 時間のインキュベーション後、元の培地を、5 μM 阻害剤 (イボシデニブ、GSK864、IDH224、FT-2102) を含む新鮮な 0.7 mL 培地 (DMEM (4500 mg L-1 グルコース)、10% FBS および 1% GlutaMAXTM) に置き換えました。 、DS-1001B) または 0.1% DMSO (対照サンプル)。 細胞を採取する前にさらに 24 時間インキュベートしました。 回収中に培地を吸引により除去した後、ウェルを１ウェル当たり０．７ｍＬのＰＢＳで２回穏やかに洗浄した。 75 μL の 80%(v/v) メタノール水溶液を各ウェルに加え、プレートをドライアイス上に置きました。 細胞をこすり取り、各ウェルの内容物を別々のマイクロチューブに移した。

細胞抽出物を14,000 gで25分間遠心分離しました。 上清の DNA 濃度 (ng μL-1) は、LVis プレート (260 nm) を備えた ClarioStar Plus を使用して測定しました。 2.5 μL の上清を各ウェルに加えました。 DNA濃度を測定する前に、プレートをウェルあたり2.5μLの80%(v/v)水性メタノールでブランクした。 残りの細胞サンプル上清を Total Recovery バイアル (Waters) に移し、DNA 濃度に対して希釈しました。 陰イオン交換クロマトグラフィー-MS 分析は、報告されているように 51、連続再生トラップカラム、Dionex ERS ​​500e サプレッサー、および AS11-HC (2 × 250 mm、4 μm) を備えた Dionex ICS-5000+ 高圧イオンクロマトグラフィー システムを使用して実行されました。コラム、すべて Dionex (米国カリフォルニア州サニーベール) 製。 これは、HESI II プローブを介して Q-Exactive HF ハイブリッド四重極 Orbitrap MS に直接結合されました (どちらも Thermo Fisher 製)。 カラム温度は 30 °C で、すべてのサンプルは 5 µL の部分ループ注入で注入されました。 移動相は、次の勾配の水酸化物イオン水溶液 (流速: 0.250 mL min-1) でした: 0 分、0 mM; 1分、0mM。 15分、60mM。 25分、100mM。 30.1分、0mM。 37分、0mM。 サプレッサーの流量は 0.500 mL min-1 で、外部水モードで使用されました。 MS は、次のソース パラメータを使用して負イオン モードで動作しました。シース ガス流量 60、シース ガス流量 60。 補助ガス流量、20; スイープガス流量、0; スプレー電圧 3.6 kV; キャピラリー温度、300 °C; S レンズ RF レベル、70; ヒーター温度、350 °C。 MS および MS/MS スキャン パラメーターは次のとおりです。マイクロスキャン、2。 解像度、7 × 104。 AGC ターゲット、1 × 106 イオン; 最大 IT、250 ミリ秒。 ループ数、10。 MSX カウント、1。 隔離ウィンドウ、2.0 m/z; 衝突エネルギー、35; 最小 AGC ターゲット、5 × 103 イオン。 頂点トリガー 1 ～ 15 秒。 電荷除外 3 ～ 8、>8; 動的除外、20.0 秒。 2-HG の保持時間は、80% (v/v) メタノール水溶液 (HPLC グレード、Sigma-Aldrich 製) 中の 1 μg mL-1 標準の分析によって決定されました。

この研究で生成された結晶学的データは、アクセッション コード 7PJM および 7PJN で PDB データベースに保管されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 この論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求に応じて対応著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

Wellcome Trust (091857/7/10/7)、Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L000121/1、sLoLa Grant BB/J001694/2 および BB/R013829/1)、Medical Research Council、この研究に資金を提供した工学物理科学研究評議会および英国がん研究 (C8717/A18245)。 RR は、Interdisciplinary Bioscience DTP、BBSRC (BB/R506655/1)、および GlaxoSmithKline を介して、Oxford-GSK-Crick Doctoral Program in Chemical Biology によって支援されました。 ICH は、Aker 奨学金を提供してくださった Anne Grete Eidsvig と Kjell Inge Røkke 教育財団に感謝します。 PR は、ドイツのレオポルディナ自然科学アカデミーの博士研究員フェローシップに感謝します。 RAH は、クラレンドン基金とトリニティ カレッジ バーケット奨学金からの資金提供に感謝しています。 非変性 MS 研究を支援してくださった Victor Mikhailov 博士と、SEC-MALS 実験を実施してくださった David Staunton 博士に感謝します。 HEK293T 細胞と pMDL、pVSVg、および pREV レンチウイルス パッケージング ベクターは、イタリア、トリノ大学の Candiolo Cancer Institute (IRCCS) の E.Vigna 氏のご厚意により提供されました。 ビームライン I03 および I24 (提案 MX-23459) でのビームタイムとサポートについて、Diamond Light Source UK のスタッフに感謝します。

ジェームズ・ウッド & メリッサ・モーガン

現在の住所: エジンバラ大学遺伝癌研究所、エディンバラ、英国

マーティン・I・アブード

現在の住所: レバノン・ビブロス/ベイルート、レバノン・アメリカン大学自然科学部

これらの著者は同様に貢献しました: Ingvild C. Hvinden、Patrick Rabe。

オックスフォード大学化学研究所化学研究所およびイネオス・オックスフォード抗菌研究所、12 Mansfield, Oxford, OX1 3TA, UK

ラファエル・ラインボルド、イングヴィルド・C・フヴィンデン、パトリック・ラーブ、イアン・J・クリフトン、ジェームズ・SO・マッカラ、マーティン・I・アブード、クリストファー・J・スコフィールド

オックスフォード大学化学科、オックスフォード、OX1 3QR、英国

ライアン・A・ヘロルド＆フレイザー・A・アームストロング

バーミンガム大学癌ゲノム科学研究所（バーミンガム、英国）

アリーナ・フィンチ、ジェームズ・ウッド、メリッサ・モーガン、キアラ・バルデラ

フライブルク大学薬学研究所、79104、フライブルク、ドイツ

マクシミリアン・シュタウト

GlaxoSmithKline、Gunnels Wood Rd、Stevenage、SG1 2NY、英国

そう、レドモンド

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CJS と MIA が研究を企画しました。 RR、MIA、および MS がタンパク質を生成しました。 RR は、UV 吸光度アッセイ、1H NMR 研究、CD、DSF 研究、および非変性ゲル分析を実施しました。 RR と PR は結晶学的研究を実施しました。 IJC は結晶学的データ解析をサポートしました。 RR は非変性 MS 研究を実施しました。 RAHとFAAは電気化学実験を実施した。 AF、JW、および MM は、IDH 変異ベクターを作成し、クローン化しました。 CB と AF は LV、IDH 変異細胞を生成し、検証を実行しました。 ICH と JSOM は細胞株の阻害剤処理とメタボローム解析を完了しました。 JRは阻害実験を支援した。 RR と CJS はこの論文を共同執筆しました。 著者全員がその論文をレビューしました。

Martine I. Abboud または Christopher J. Schofield との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Christal Sohl と匿名の査読者に感謝します。

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転載と許可

Reinbold, R.、Hvinden, IC、Rabe, P. 他イソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1 変異体阻害剤イボシデニブに対する耐性は、代替の二量体界面結合阻害剤によって克服できます。 Nat Commun 13、4785 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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受信日: 2022 年 4 月 11 日

受理日: 2022 年 7 月 25 日

公開日: 2022 年 8 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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血液腫瘍学ジャーナル (2023)

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