酸化グラフェン - 株式会社ペチーノノーザンライツ

Scientific Reports volume 6、記事番号: 21867 (2016) この記事を引用

4182 アクセス

55件の引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

酸化グラフェン (GO) は特定の外部起電力細菌によって還元されますが、細菌の増殖と代謝に対するその影響については議論の余地があります。この研究は、GO が外部起電力細菌の特異的な増殖と電力生産を可能にする末端電子受容体として機能するかどうかを判断することを目的としました。 GO と酢酸塩を唯一の基質として環境サンプルを培養すると、Geobacter 種が優勢 (総人口の 51 ～ 68%) する体外起電力性細菌が特異的に濃縮される可能性があります。興味深いことに、これらの培養物中の細菌は、生物学的に還元された GO (rGO) とともに自己凝集して導電性ヒドロゲル複合体を形成しました。新規のGO呼吸細菌はGeobacter sp.と命名された。 R4株はこのヒドロゲル複合体から単離された。この生物は、グラファイトフェルトを使用して一時的に発電しながら、rGO を介して 60 日間以上、>1000 μA/cm3 (Ag/AgCl に対して 200 mV で) の安定した発電を示しました。より良い発電は、バイオフィルム成長のための大きな表面積、より大きな静電容量、より小さな内部抵抗などの rGO の特性に依存します。これは、rGOとの導電性ヒドロゲル複合体を形成しながら、GO依存性の体外起電力性細菌の増殖を実証した最初の報告である。 rGO と体外電子のヒドロゲル複合体の形成につながる単純な置くだけのプロセスにより、GO の生物電気化学システムへの幅広い応用が可能になります。

生物電気化学システム (BES)1 または微生物電気化学システム (MES)2 は、微生物を触媒として使用する電気化学反応の装置です。微生物燃料電池（MFC）は、有機化合物の微生物による酸化を介して電極に電子を生成する BES の代表的なものです3。体外起電性細菌は、細胞外電子伝達 (EET)4 と呼ばれる独自の機能を特徴とし、BES における電力生成のメディエーターです。 Geobacter 属と Shewanella 属のメンバーは、電極への付着によって直接、および酸化還元メディエーターを介して間接的に電子を伝達できる、最も研究されている体外電子です 5,6。

BES の性能は、主に電極上で発達する細菌バイオフィルムの EET に関連していますが、装置内の浮遊細胞による間接的な EET とはあまり関連していません 7。したがって、電極材料は、バイオフィルムの形成と細胞電極界面での電子伝達のパフォーマンスの重要な決定要因です。炭素電極は化学的に安定であり、細菌バイオフィルムの発達に適しているため、このタイプの電極は BES に好ましく適用されています 8,9。特に、グラファイトフェルト、カーボンブラシ、カーボンクロスは、市販性、実験性能、経済性などの点から実用化が検討されている。電極の性能に影響を与える可能性のある重要な要素の 1 つは表面積です。表面積が大きい電極は、裸のカーボンまたはグラファイトよりも多くの細菌細胞の付着を可能にする可能性があります10。この研究分野における最近の技術進歩は、より高い性能を示すグラフェン誘導体を使用することによるアノードの修飾である11、12、13。

炭素原子の単層ハニカム格子であるグラフェンは、高い導電性と、さまざまなオーダーで大きな表面積（たとえば、グラフェンの場合は 2965 m2/g14、グラファイトフェルトの場合は 0.02 m2/g10）を有するという利点があります。しかし、グラフェンは疎水性の粉末であり、BESに使用するには支持電極との複合体である必要があるため、BESに直接適用することは困難です。グラフェンの酸化型である酸化グラフェン (GO) を BES の反応チャンバーに添加すると、炭素電極への電子移動が強化されることが示されています 15、16。 GO 自体は導電性ではありませんが、微生物によって還元されると導電体になります 17,18。ここでは、GO のこの還元型は、その化学的正体に関する情報が入手できないため、単に還元型 GO (rGO) と呼ばれます。細菌による GO の減少は、最初に Shewanella 種の培養物で実証され、その後、大腸菌 19 および複雑な混合集団 20 で実証されました。 Shewanella 種は、EET に関与する酸化還元タンパク質を使用することで GO を減少させました 17,18。また、シュワネラ培養物からの無細胞抽出物中の GO は、おそらくビタミン C21 などの小さな生体分子によって減少しました 17。これらの発見は、GOが外部起電力性細菌の基質の酸化と共役するEETの電子受容体として機能し、それによって細菌の増殖を可能にするかどうかという疑問を提起する。これまでのところ、GO 呼吸による細菌の増殖はまだ十分に実証されていません。一方で、GO には抗菌または殺菌活性があることも示されています 22,23。これらの結果は、GO が単純な電子シンクとして機能するが、呼吸成長を可能にする末端電子受容体としては機能しないという別の仮定を提供します。したがって、細菌の増殖と代謝に対する GO の影響に関する情報は、現時点では断片的かつ不明確です。この状況により、BES への GO の適用が制限されています。

GO は、BES への応用においてグラフェンよりも大きな利点を持つ可能性があります。その理由の 1 つは、GO がグラフェンよりも経済的であること、また、GO の親水性により、水溶液中でより多くの細菌細胞がその表面に付着できる可能性があるためです。 GO が外部起電力性細菌の増殖をサポートする末端電子受容体として機能できる場合、GO は環境からこれらの細菌を選択的に濃縮するのに役立つ可能性があります。また、GO は水溶液中で化学的に還元されると自己凝集してヒドロゲルになることに注目することは非常に興味深いです 24。このことから、GO は EET 駆動体外電子と導電性 rGO の高密度集合複合体の形成に使用できることが期待されます。

この研究の主な目的は、外部起電力性細菌の選択的増殖と自己凝集が GO に応じて起こるかどうかを判断することでした。この目的のために、我々は環境から GO 呼吸細菌 (GORB) の濃縮培養物を作成することを試み、EET から電極への電力生成についてこれらの GORB を検査しました。濃縮された GORB の系統学的組成は、16S rRNA 遺伝子アンプリコンのハイスループットシーケンスによって決定されました。本明細書で報告されているように、GORBとrGOの導電性ヒドロゲル複合体を作製するという我々の試みは肯定的な結果をもたらした。我々の知る限り、この研究は、発電可能なrGOとのヒドロゲル複合体への自己凝集を伴う体外起電力性細菌のGO依存性増殖を実証した最初の研究である。

この研究で使用した GO サンプルは粉末として市販されており、2 時間の超音波処理によって水に分散されました。調製されたGOは、AFM画像に見られるように、厚さ1.5 nmの単層シートでほぼ構成されており、XPSでは287 eVに豊富なC = Oピークと285 eVにCC / CHピークがありました（補足図S1）。 GO シートの面積は平均 0.26 ± 0.46 μm で変動しました。

環境サンプルから GORB を濃縮するために、酢酸塩が唯一の炭素源およびエネルギー源として使用されました。酢酸塩および化学的に還元された GO の酸化還元電位は、SHE (標準水素電極) に対してそれぞれ -290 mV25 および +380 mV26 でした。両者の還元電位の差は、酢酸酸化と結合した呼吸による GO 還元によるエネルギーの生成とその結果としての成長にとって熱力学的に有利です。

GORB の濃縮は、河川水 (RW)、水田土壌 (PS)、水路堆積物 (WC) という 3 つの異なる淡水環境サンプルをシードとして使用して実行されました。これらのサンプルを GO および酢酸塩とともに数日間インキュベートしました。次に、培養物の一部を新鮮な培地に移して培養を継続した。 10 回以上の繰り返し移植と培養により、培養物 RW、WC、および PS と呼ばれる高濃度培養物が得られました。

濃縮プロセスの開始時に、添加された GO は培養物中に完全に分散し、茶色の懸濁液が得られました (図 1A)。その後、培養物は徐々に黒くなり、10 日間のインキュベーション中に高密度のヒドロゲル複合体が形成されました。 XPS分析により、3つの培養物中のGOは、0日目にC = Oの場合は約287 eV、CC / CH結合の場合は285 eVにそれぞれ2つの主要なピークを持つC1sスペクトルを有することが示されました（図1B）。すべての文化において、最初は C = O ピークが優勢で、時間の経過とともに徐々に低下しました。一方、CC/CH ピークが支配的になり、C = O ピークはほぼ消失しました。対照としてオートクレーブ処理した培養物では、外観および XPS ピークの変化がまったくまたはほとんど観察されませんでした (図 1A、B)。これらの観察は、茶色から黒色への色の変化によって判断される GO の減少が微生物の活動に依存することを示しました。

濃縮培養における微生物細胞の GO 依存性増殖と自己凝集。

(A) オートクレーブ処理した無傷の細胞を接種した 3 つの濃縮培養物 (培養物-RW、-PS、-WC) の外観。自己凝集ヒドロゲル複合体の形成を示しています。 (B) 10 日後のオートクレーブ滅菌または無傷の接種材料を含む培養物中の GO および部分的に還元された GO の XPS データ。 (C) 10 日後の GO を含む培養物と含まない培養物中の酢酸濃度。 (D) 10 日後の GO およびアセテート (ACE) を含む培養物と含まない培養物における細胞密度。

3 つの濃縮培養では、酢酸塩は GO の減少とともに消費されましたが、GO のない対照では変化しませんでした (図 1C)。 C = O ピーク強度と酢酸塩濃度の同時減少は、GO の還元が酢酸塩の酸化と連動していることを示唆しました。ヒドロゲル複合体が均質化によって水相に分散された場合、細胞密度は、添加剤のいずれかまたは両方を含まない培養物よりも GO およびアセテートで修正した培養物の方が約 20 倍高く、これは (4.0 ～ 7.6) × 106 に相当します。細胞/mL (図 1D)。現在の細菌が増殖に GO と酢酸塩の両方を必要としたという事実を考慮すると、この増殖は実際には GO を末端電子受容体として、酢酸塩を炭素およびエネルギー源として使用する嫌気呼吸に依存していると結論付けるのは論理的です。

GO を含む濃縮培養物では、80 ±12% の細胞が開発されたヒドロゲル複合体に分布していました (表 1)。ヒドロゲル複合体の SEM イメージングにより、複合体の表面に細菌の細胞構造が含まれていることが明らかになりました (図 2)。 3つの培養物中の細菌の形態型は、湾曲した桿菌が豊富であり、球菌が時折観察されたため、互いに類似していた。これらの細胞構造は、インキュベーション前の GO 自体では観察されませんでした。

GO および rGO-GORB 複合体の SEM 画像。

(A) この研究で使用した GO の SEM 画像。（B〜D）培養物中のrGO-RGOB複合体のSEM画像-それぞれRW（B）、-PS（C）、-WC（D）。

rGO および GORB の黒色ヒドロゲル複合体中の細菌を同定するために、これらの複合体からの 16S rRNA 遺伝子を PCR 増幅し、Illumina MiSeq プラットフォームを使用したハイスループットシークエンシングによって分析しました。 3 つの培養物すべてにおいて、よく知られた外部電磁細菌である Geobacter 種の 16S rRNA 遺伝子が最も豊富で、アンプリコン全体の 51 ～ 68% を占めていました (図 3)。 Geobacter 細菌のほかに、Azospira のメンバーが 3 つの培養すべてで顕著に検出され、総人口の 28 ～ 42% を占めました。酢酸酸化剤であるアゾスピラ種は、MFC の陽極チャンバーで頻繁に検出されています 27,28。

GO で増殖した細菌の同定。

3 つの文化 (文化-RW、-PS、-WC) における運用分類単位 (OTU) の系統学的識別の円グラフ。 1% を超える頻度を持つ OTU がグラフに示されました。

上で述べたように、GO とアセテートの濃縮プロセスを通じて rGO-GORB ハイドロゲル複合体を取得することに成功しました。これらの錯体が酢酸塩を電気に変換する能力を確実にするために、+200 mV (対 Ag/AgCl) で分極させました。 3つの複合体すべてで電気が急速に生成され、最大レベルは1〜2日目に1,000〜1,300μA/cm3の範囲で現れました（図4A）。電力生成は時間の経過とともに徐々に減少しましたが、酢酸塩を添加すると回復しました。即時かつ安定した電気の生成は、分極後の複合体における GO 還元性外電子の顕著な成長と安定した活性によるものでした。 5.0 mM 酢酸塩を 3 回添加して分極を 10 ～ 20 日間行った後、3 つの培養物の総細胞数は (3.7 ～ 4.9) × 109 ～ (0.53 ～ 3.8) × 1012 細胞/培養の範囲でした (表 1)。 64 ～ 89% が複合体内に存在していました。単位体積あたりの細胞密度は、浮遊細胞を含む液相（1.7 × 108 ～ 5.3 × 108 細胞/mL）よりも、複合体の方が 160 倍高かった（0.5 × 1011 ～ 3.1 × 1011 細胞/cm3）。すべての複合体において、Geobacter 種が電気化学的に増殖した個体群の圧倒的多数 (77 ～ 91%) を構成しました (補足表 S1)。

rGO-GORB複合体による電力生産。

(A) RW、PS、および WC を接種した rGO-GORB 複合体によって生成される電力の変化。 (B) 3 つの rGO-GORB 複合体によって得られた CV。 (C) 3 つの rGO-GORB 複合体によって得られた EIS。グラフ内の数字は周波数です: f [Hz] = ω/2π。

3 つの rGO-GORB 複合体の CV 曲線は、酢酸酸化の触媒電流、たとえば、スキャン速度 0.2 mV/s の Ag/AgCl に対して 500 mV で 1200 ～ 1700 μA/cm3 を示しました (図 4B)。明らかな酸化還元ピークは現れなかった。培養物 RW および PS のボルタモグラムは、対称的な電流の放電を示し、電気二重層容量が rGO-GORB 複合体の大きな表面積に依存していることを示しました。 WC 培養では、CV 曲線は電位が低いほど歪むようになりました。 3 つの複合体の生データを使用したナイキストプロット (図 4C) に基づくと、半円の直径として表される電荷移動抵抗 (Rct) は、培養 RW および PS では <1.0 Ω/cm3、培養では 1.0 ～ 2.0 Ω/cm3 でした。培養トイレ内のΩ/cm3。 WC 内の 2 つの明らかな半円は、2 つの電気化学反応が関与していることを示していました。より小さい半円は、RW および PS 培養で観察されたものと類似しており、Geobacter による電気化学的速度論的反応が起こったことを示唆しています。より大きな半円は、WC (総人口の13%) では確実に増殖するが、RW および PS では増殖しないか、またはあまり増殖しない (<0.1％) など、他の細菌による電気化学的動力学的反応の関与を示した可能性があります (補足表 S1)。

濃縮されたジオバクター細菌が実際に GO 呼吸によって増殖できるかどうかを判断するために、GO を含む嫌気性寒天培養によって濃縮培養物からジオバクターを分離する試みが行われました。結果として、RW培養物は寒天培地中にGO還元陽性として大きな黒いハローを有する小さなコロニーを生成した(図5A)。この寒天プレートからの単一コロニーは、寒天希釈を繰り返すことによって首尾よく精製され、株Ｒ４として設計された。 16S rRNA 遺伝子配列決定により、R4 株は実際にジオバクター属のメンバーとして同定され、ゲオバクターブレーメンシス Df1T 株 (アクセッション番号 U96917) が 99.3% の類似性レベルで最も近い近縁種であることが判明しました。

Geobacter sp. の GO 依存性増殖と自己凝集 R4細胞を株化します。

(A) GO 還元陽性として、寒天プレートにおける R4 株による黒いハローの形成。 (B) 無傷(上)およびオートクレーブ処理した(下)接種材料を接種したR4培養物におけるGOの減少および細胞のヒドロゲル複合体への自己凝集。 (C) 無傷の R4 培養物における C1s スペクトルの XPS データ。 (D) GO の有無にかかわらず、無傷の R4 培養物中の酢酸濃度。 (E) GO およびアセテート (ACE) を含む場合と含まない場合の、インタクトな R4 培養物における 16S rRNA 遺伝子のコピー数。

Geobacter sp.の純粋培養物。 R4株はGOを還元し、培養RWで見られるものと同様にrGOとの黒色ヒドロゲル複合体（rGO-R4複合体）を形成することができた（図5B、C）。 R4 株は rGO-R4 複合体を形成するのに 30 日を要しましたが、混合培養では rGO-RW 複合体を形成するのに 10 日かかりました。 R4 株の嫌気性増殖は、酢酸塩の消費と GO の減少とともに発生しました (図 5D、E)。 36日目に複合体の異なる位置から採取した3つのサンプルのXPS分析では、主要なC1sピークとしての豊富なCC結合が繰り返し観察され（補足図S2）、複合体中のGOが全面的に減少したことを示唆しています。 rGO-R4複合体の電気伝導率は16 mS/cmで、これは微生物の減少によって元のGOについて記録されたものよりもはるかに高かった（補足図S3A、B）。

これらの結果は、Geobacter sp. R4 株は、他の微生物との会合なしに GO 呼吸により嫌気的に増殖し、rGO と導電性ヒドロゲルを形成することができます。

rGO-R4 複合体の発電能力が調べられました。比較のために、MFC で広く使用されている代表的なアノードであるグラファイトフェルト (GF) を使用しました。どちらの複雑なシステムでも、存在する細胞の数は複合体あたり約 8.0 × 108 細胞でした。株 R4 の細胞は、両方の複合体で 7 日間以内に 1,300 ～ 1,700 μA/cm3 の電気を生成しましたが、使用したアノードに応じて異なる生成プロファイルを示しました (図 6A)。 GF-R4 複合体の電気は時間の経過とともに徐々に減少し、酢酸をスパイクしても回復しませんでしたが、rGO-R4 複合体の電気は安定して発生しました。これらの結果は、補足図S2に示すように、繰り返しのアッセイで高度に再現されました。 rGO-R4 培養液中の酢酸濃度は、20 日間のインキュベーション後に検出限界より低くなりました。一方、添加された酢酸塩（8.0 mM）の半分以上がGF-R4培養物にまだ残っていました（補足図S4）。これらの結果は、rGO-R4 培養物が GF-R4 培養物よりもはるかに効率的に酢酸を酸化し、発電できることを示しています。

Geobacter sp.による発電 GO とグラファイトフェルトをアノードとして使用して R4 をひずみます。

(A) rGO-R4 (緑色) および GF-R4 (紫) 複合体の電気的変化。 (B) 30 日間のインキュベーション後の rGO-R4 および GF-R4 複合体の外観。 (C) 30 日間のインキュベーション後の rGO-R4 および GF-R4 複合体の SEM 画像。 (D) rGO-R4 および GF-R4 複合体によって得られた CV 曲線。 (E) rGO-R4 および GF-R4 複合体によって得られた EIS データ。挿入図は、狭い範囲の同じデータを拡大したものです。グラフ内の数字は周波数です: f [Hz] = ω/2π。

rGO-R4 複合体は、1 週間の分極後にピンク色に変わりました (図 6B)。この時間依存の着色は、ジオバクターの多層バイオフィルムで典型的に見られるものと同様でした。 rGO-R4 複合体の細胞密度は 8.0 × 108 細胞/cm3 から 3.6 × 1010 細胞/cm3 に変化し、培養全体の総細胞数の 93% を占めました (表 2)。 SEM観察により、rGO-R4複合体の表面は実際に豊富な細胞で覆われていることが示された(図6C)。これらの結果はすべて、電気分極によって rGO-R4 複合体上に多層バイオフィルムが形成されることを示唆しています。対照的に、GF-R4 培養物では、明らかなバイオフィルムは発達しませんでしたが、ピンク色の濁った液相が形成されました (図 6B)。 GF-R4 培養物中の細胞の総質量は、rGO-R4 培養物中の細胞の総質量の 6.4% にすぎず (表 2)、細胞の 64% が浮遊性でした。このバイオマスレベルの低下は、GF-R4 培養における電気化学的および生理学的プロファイルに関連している可能性があります。

発電に対するrGO-R4複合体のヒドロゲル構造の影響を評価するために、GOの有無にかかわらずコーティングされたグラファイトを使用してR4株を電気的に培養しました（補足図S5およびS6）。どちらの培養でも、R4 株はグラファイトの表面にバイオフィルムを形成し (補足表 S3)、電気を生成しました。ただし、ヒドロゲル複合体の場合とは異なり、両方の文化における電力生産は時間の経過とともに徐々に減少しました。これらの結果は、ヒドロゲル構造が R4 株による発電を維持するために重要であることを示しています。

分極後の rGO-R4 複合体の CV 分析では、rGO-R4 複合体では 500 mV (対 Ag/AgCl) で GF-R4 複合体 (470 μA/cm3) よりもはるかに高い触媒電流 (1,300 μA/cm3) が示されました。）（図６Ｄ）。 rGO によるより大きな電気生成は、おそらく GF で観察されたものよりも大きな静電容量とはるかに小さな抵抗によるものと考えられます (図 6E)。 EIS データは、GF-R4 複合体よりも rGO-R4 の Rct が 10 倍小さいこと、つまりそれぞれ <1.0 Ω/cm3 および >10 Ω/cm3 であることを明らかに示しました。理想的な電気化学反応では、静電容量 (C) は Rct と半円の頂点を示す角周波数 (ωmax) に反比例します (ωmaxCRct = 1)。したがって、rGO-R4 の静電容量は GF-R4 の静電容量よりも大きいと推定できます。

rGO-R4 複合体のより優れたパフォーマンスも、電気分極前であっても観察されました (補足図 S7)。この結果から、rGO-R4複合体はバイオフィルム形成前から電気二重層容量があり、電荷移動抵抗が小さいことが明らかとなった。分極後に複合体上に形成されたバイオフィルムは、0.46 mS/cm の電気伝導率を示しました。これは、rGO 複合体の値 (16 mS/cm) よりもはるかに低いです。これらの結果は、潜在的に部分的にバイオフィルムによってサポートされているものの、より大きな電気容量とより小さな電荷移動抵抗が、複合体上のバイオフィルムではなくヒドロゲル複合体自体から提供されることを示した。

GO は BES への応用が大いに期待できるナノ材料ですが、細菌の増殖と代謝に対するその効果に関しては議論が続いています。過去 10 年間に、GO がさまざまな種に対して抗菌または殺菌効果があることが多くの研究で示されています 22、23、29、30。したがって、この研究の主な目的は、GO が外部起電力性細菌の増殖をサポートする末端電子受容体として機能するかどうかを判断することであり、これを実証する我々の試みは成功しました。 GO 依存性の増殖により、複合体中の外部起電力性細菌の選択的濃縮が可能になりました (図 1 および 3)。このプロセスの使用には、他の非生物的な GO 削減技術よりも GO を削減する大きな利点があります。抗菌活性を示す以前の研究と我々の研究の矛盾した結果は、おそらく GO を設定した実験条件の違いから生じていると考えられます。最近の論文では、GO の抗菌活性は小さいサイズの GO でコーティングされた表面でのみ検出可能であり、水溶液中では検出できないことが示されています 31,32。したがって、我々が発見した外部起電力性細菌の増殖は、水溶液中の GO の非細胞毒性状態によって誘導される可能性があります 31。

この研究で最も印象的な観察の 1 つは、環境サンプルの培養により、導体として機能する体外起電性細菌と rGO の自己凝集ヒドロゲル複合体が形成されたということです。このヒドロゲル形成のメカニズムは正確には不明ですが、これはおそらく、以前に GO から rGO ハイドロゲルへの水熱還元で観察されたように、rGO の部分的な π-π スタッキングによって引き起こされると考えられます 24。したがって、rGO ハイドロゲルの形成はおそらく細菌の GO 還元能力に依存します。 Shewanella 種 17、18 および Escherichia coli 19 を GO とともに培養すると、得られた rGO はフロックとして存在しましたが、ヒドロゲル複合体としては存在しませんでした。それにもかかわらず、これらの細菌種は、この研究で使用したのと同じ培養条件下で rGO ハイドロゲルを形成する可能性があります。したがって、本研究は、rGOと細菌の高密度集合体としての生体伝導体の新しいモデルを提供する。

本明細書で報告されているように、環境からヒドロゲル複合体中にGOが豊富に含まれるGeobacter個体群は、水田土壌33、湿地堆積物34、帯水層堆積物35などの自然環境で検出される個体群よりもはるかに多い。また、rGO-GORB複合体には、酢酸塩を与えたMFCよりも多くのGeobacter集団が含まれており、Geobacterが総集団の14〜60％を占めていたことも注目に値します36、37、38、39。これは、電気分極下での従来のシステムと比較して、GO を使用した培養がジオバクターやその他の EET 駆動細菌の選択的濃縮に有用であることを示唆しています。 Geobacter 種に加えて、Azospira のメンバーも濃縮培養物中でかなりの割合 (合計 28 ～ 41%) で検出されました。アゾスピラ種は MFC で頻繁に検出されていますが 27、28、それらのいずれも細胞外電子受容体を減少させることは報告されていません。 Geobacter や Shewanella 種 40 などの EET 駆動細菌の特徴の 1 つは、フミン物質を酸化する能力であり、同様に、Azospira 株もフミン物質を酸化することが報告されています 41。これらの総合的な結果に基づいて、rGO-GORB 複合体内のアゾスピラ細菌が GO の還元に関与していると推測できます。培養トイレでは、極性化によりスルフロスピリルムの割合が 6.1% から 13% に増加しました。これを考慮すると、スルフロスピリルムのメンバーが酸化鉄に対して EET できるという事実 42 と合わせて、これらの細菌は rGO-GORB 複合体における電力生産に役割を果たしている可能性があります。

ジオバクター sp. この研究で新たに分離された細菌であるR4株は、rGOではバイオフィルムの成長と安定した電力生産を示し、GFでは浮遊増殖と一時的な電力生産を示しました（図6）。 2つの培養物間の生物電気化学的特徴のこの違いは、R4株が炭素材料に応じてEETのモードを変化させる、つまり直接EETからrGOへ、そして水性酸化還元分子を介して間接的にEETからGFへ変化することを示唆している。体外起電性のジオバクター種では、直接 EET が c 型シトクロムや導電性バイオフィラメントを含む外膜タンパク質によって触媒されることが示されています。分極下での Shewanella oneidensis 43 の浮遊細胞増殖は、フラビンなどの電子シャトルの生成に関連しています 44。純粋培養によるEETモードの電極依存性スイッチングがこの研究で初めて発見されたことは注目に値する。ジオバクター sp.のユニークな特徴 R4 株は、外部起電力性細菌と炭素電極の相互作用を包括的に理解するための新たな洞察を提供します。

我々の知る限り、この研究は、GO依存性の体外起電力性細菌の選択的増殖と、バイオマスとrGOの自己凝集ヒドロゲル複合体の形成を実証した最初の研究である。 rGO-GORB 複合体は、GF を使用したシステムよりもバイオフィルムの成長が良好で、内部抵抗がはるかに小さく、静電容量が大きくなります。 rGO-バイオマス複合体への自己凝集と細菌と電極間のEETの強化につながる、単純な置くだけのプロセスは、BESにおけるGOの応用の拡大に貢献します。

GO 粉末は、Royal Elite New Energy Science & Technology Co., Ltd (上海、中国) から購入しました。 GO を滅菌 MilliQ 水に溶解して 10 g/L の濃度にし、Bransonic モデル CPX 超音波処理装置 (Branson Ultrasonics、日本エマソン株式会社、厚木市) を使用して 2 時間以上超音波処理し、保存するまで 4 °C で保存しました。使用。このようにして調製した GO の厚さとフレーク面積を、Agilent PicoPlus 5500 原子間力顕微鏡 (Agilent Tech. Inc.、カリフォルニア州サンタクララ) で分析しました。

GO および生物学的に還元された GO (rGO) の化学状態を X 線光電子分光法 (XPS) によって分析しました。この分析では、GO と rGO をシリコンウェーハ上に堆積し、乾燥させました。シリコンウェーハを収集し、MilliQ 水で数回洗浄し、前述のように乾燥させました 17。 XPS スペクトルは、単色 Al Ka X 線源を備え、10-6 Pa 未満の裸圧力で動作する XPS 装置 Versa Probe PHI-5000 (ULVAC-PHI Inc.、大阪、日本) を使用して測定されました。 C1 のレベルスペクトルは、0 ～ 1,100 eV にわたるサーベイスキャン後の集中スキャンによって取得されました。

GORB は、炭素およびエネルギー源として酢酸塩、電子受容体として GO を含む化学的に定義された培地を使用した環境サンプルの嫌気培養によって濃縮されました。シードとして、河川水（RW 設計、北緯 34 度 42 分 22 秒、東経 137 度 23 分 31 秒）、水路内の堆積物（WC 設計、34 度 42 分 26 秒）の 3 つの異なる環境サンプルを使用しました。 ”N、137°23'42”E）と水田土壌（設計されたPS、34°42'37”N、137°23'47”E）。 3 つの培養物 RW、WC、および PS を独立してインキュベートし、サポート情報に記載されているように定期的に新鮮な培地に順次移しました。濃縮に続いて、裏付け情報に記載されているように、寒天希釈技術によって濃縮培養物から GORB を単離しました。

濃縮および単離された GORB は、16S rRNA 遺伝子の配列決定によって系統学的に同定されました。濃縮培養物からの 16S rRNA 遺伝子は、バルク DNA をテンプレートとして PCR 増幅し、サポート情報に記載されているように Illumina MiSeq システムを使用して配列決定しました。濃縮培養物から分離したGORBを、プライマー27fおよび1492rを使用して16S rRNA遺伝子のPCR増幅に供した(表1を裏付ける)。 16S rRNA 遺伝子アンプリコンは、前述のように Applied Biosystems Big Dye Terminator V3.1 キット (Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド) および Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Life Technologies) を使用して配列決定されました 45。

培養液中の酢酸塩の定量のため、培養液の一部を採取し、L-column2 ODS (4.6 × 250 mm) (CERI、東京、日本) を備えた逆相 HPLC システム (島津製作所、京都、日本) を使用して分析しました。および前述の UV 検出器 46。濃縮培養物、RW、PS、および WC の直接の総細胞数は、SYBR GREEN II 染色を用いた落射蛍光顕微鏡法によって測定されました 47。 R4 株の純粋培養における細胞増殖をモニタリングするために、細菌 16S rRNA 遺伝子、357f および 517r のユニバーサルプライマーセットを使用してリアルタイム qPCR を実施しました（補足表 S2）。 qPCR は、以前に記載されているように、LightCycle FastStart DNA Master SYBR Green I キット (Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス) および LightCycle Nano システム (Roche Applied Science、インディアナ州インディアナポリス) を使用して実行されました 45。標準として、R4株のゲノムDNAから精製した16S rRNA遺伝子アンプリコンを使用した。

rGO-GORB複合体における微生物電気生成のアッセイのために、GORBの濃縮純粋培養物を、以下のわずかな変更を加えて容量0.93Lのガラス瓶(サイズ、直径90mm、高さ175mm)中でインキュベートした。濃縮培養物を接種した複合体については、AGOFS と呼ばれる嫌気性ミネラル培地 1 L を 2 L ガラス瓶に調製し、オートクレーブ滅菌しました (補足情報を参照)。 rGO-R4複合体については、AGOSF培地も同様に調製した。オートクレーブ処理後、培地を 0.67 g/L の GO および 15 mL の前培養物と混合し、ガラス瓶に充填してヘッドスペースを除去しました。次に、ガラス瓶を 28 °C で 1 か月間インキュベートしました。インキュベーション後、直径約 30 mm、高さ 10 ～ 20 mm のヒドロゲル複合体が得られました。

SEM イメージングでは、サポート情報に記載されているように、rGO-GORB 複合体を 2% グルタルアルデヒドと 1% 四酸化オスミウムで固定しました。調製したサンプルを金でスパッタコーティングし、1.0 kV で動作する電界放射型走査型電子顕微鏡 SU8000 (株式会社日立製作所、東京、日本) で観察しました。

電気化学的培養には、作用極として白金線を接続した容量０．９３Ｌの滅菌ガラス瓶（直径９０ｍｍ、高さ１７５ｍｍ）を使用した。ボトルをAGOS培地(サポート情報を参照)で満たし、これにrGO-GORB複合体を添加した。比較のために、直径 30 mm、厚さ 20 mm の GF を代表的な MFC アノードとして使用しました。 GFをR4の細胞懸濁液に浸漬し、GF保持細胞をGF-R4複合体として使用した。 Ag/AgCl (KCl 塩) 電極と別の白金線をそれぞれ参照電極と対電極として使用しました。分極は、ポテンシオスタット HA-1510 (北斗電工、東京、日本) を使用して、作用電極電位を Ag/AgCl に対して +200 mV に設定することによって実行されました。分極中、データロガー（T&D Corporation、長野県、日本）を使用して電流を60分ごとに記録した。

rGO-GORB 複合体のサイクリックボルタンメトリー (CV) 分析と電気化学インピーダンス分光法 (EIS) は、電気化学測定システム HZ-7000 (北斗電工、東京、日本) を使用して実施されました。 CV および EIS 分析は、5.0 mM 酢酸塩で 2 時間安定化させた後、上記の電気化学的培養に使用したものと同じボトルを使用して実行しました。 CVは、-400～600 mV（対Ag/AgCl）の電位範囲で、0.2 mV/sのスキャン速度で実行されました。 EISは、印加されたAC信号に対して200 mV、20 mV振幅で100 kHz〜0.5 mHzの周波数範囲でrGO-GORB複合体について検査されました。ナイキストプロットは、EIS データ分析ソフトウェア ZSimpWin (Princeton Applied Research、テネシー州オークリッジ) を使用して分析されました。 CV および EIS 分析は、RW および PS 培養からの複合体については分極の 10 日で実行され、一方、WC 培養からの複合体については 20 日で実行されました。株R4との複合体の場合、データはrun2のrGO複合体およびGF複合体から分極の7日および12日で得られました（補足図S2）。

本研究で決定された R4 株の 16S rRNA 遺伝子配列は、DDBJ 受託番号 LC076693 (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html) として寄託されています。 Illumina MiSeq 配列のコンパイルされたセットは、アクセッション番号 DRA003954 で Short Read Archive データベースに保管されました。

この論文の引用方法: 吉田直也ほか酸化グラフェンに依存した成長と自己凝集による外部起電力性細菌のヒドロゲル複合体への反応。科学。議員6、21867; 土井: 10.1038/srep21867 (2016)。

ベルギー、ローガン微生物燃料電池およびその他の生物電気化学システムをスケールアップしています。応用微生物。バイオテクノロジー。 85、1665–1671 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

Wang, H. & Ren, ZJ プラットフォーム技術としての微生物電気化学システムの包括的なレビュー。バイオテクノロジー。上級 31、1796–1807 (2013)。

PubMed Google Scholar

ローガン、BE 微生物燃料電池に電力を供給する外部起電性細菌。ナット。 Rev.Microbiol. 7、375–381 (2009)。

CAS PubMed Google Scholar

DR ラブリーバグジュース: 微生物を使って電気を収穫する。ナット。 Rev.Microbiol. 4、497–508 (2006)。

CAS PubMed Google Scholar

ラヴリー博士、電気微生物学。アン。 Rev.Microbiol. 66、391–409 (2012)。

CAS Google スカラー

Kata, S. 微生物の細胞外電子伝達の生物工学的側面。微生物。環境。 30、133–139 (2015)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Fan, Y.、Sharbrough, E. & Liu, H. 微生物燃料電池の内部抵抗分布の定量化。環境。科学。テクノロジー。 42、8101–8107 (2008)。

ADS CAS PubMed Google Scholar

Wei, J.、Liang, P.、Huang, X. 微生物燃料電池用電極の最近の進歩。バイオリソース。テクノロジー。 102、9335–9344 (2011)。

CAS PubMed Google Scholar

Ghasemi、M.ら。微生物燃料電池の電極材料としてのナノ構造カーボン: 包括的なレビュー。 J.合金。コンプ。 580、245–255 (2013)。

CAS Google スカラー

サウスカロライナ州チャウドゥリおよびDR のラヴリーメディエーターレス微生物燃料電池におけるグルコースの直接酸化による発電。ナット。バイオテクノロジー。 21、1229–1232 (2003)。

CAS PubMed Google Scholar

Yong, Y.-C.、Dong, X.-C.、Chan-Park, MB、Song, H. & Chen, P. 高性能微生物燃料電池用のポリアニリンハイブリッド三次元グラフェンをベースとしたマクロ多孔性モノリシックアノード。 ACS Nano 6、2394–2400 (2012)。

CAS PubMed Google Scholar

Xie、X.ら。微生物燃料電池用の高性能低コストアノードとしてのグラフェンスポンジ。エネルギー環境。科学。 5、6862–6866 (2012)。

CAS Google スカラー

ン、F.-L. 他。藻類バイオ太陽光発電プラットフォームでの潜在的な応用のための還元酸化グラフェンアノード。科学。議員番号 4、7562 (2014)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chae, HK et al. 高い表面積、多孔性、および結晶内の大きな分子の包含へのルート。ネイチャー 427、523–527 (2004)。

ADS CAS PubMed Google Scholar

Yuan, Y.、Zhou, S.、Zhao, B.、Zhuang, L. & Wang, Y. 微生物燃料電池における細胞外電子伝達を促進する微生物還元グラフェン足場。バイオリソース。テクノロジー。 116、453–458 (2012)。

CAS PubMed Google Scholar

後藤祐樹ほか土壌微生物燃料電池および植物微生物燃料電池における酸化グラフェンによる発電の強化。フロント。バイオエンジ。バイオテクノロジー。 3、42（2015）。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Salas, EC、Sun, Z.、Luttge, A. & Tour, JM 細菌の呼吸による酸化グラフェンの還元。 ACS Nano 4、4852–4856 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

Wang, G.、Qian, F.、Saltikov, CW、Jiao, Y. & Li, Y. Shewanella による酸化グラフェンの微生物還元。ナノ解像度。 4、563–570 (2011)。

CAS Google スカラー

Akhavan, O. および Ghaderi, E. 大腸菌は、自己制限的な方法で酸化グラフェンを殺菌性グラフェンに還元します。カーボン 50、1853 ～ 1860 年 (2012)。

CAS Google スカラー

谷澤裕也ほか微生物を介した還元酸化グラフェン膜の合成。Ｊ．Ｐｈｙｓ．会議サー。 352、012011 (2012)。

Google スカラー

フェルナンデス・メリノ、M. 他ビタミン C は、酸化グラフェン懸濁液の還元におけるヒドラジンの理想的な代替品です。Ｊ．Ｐｈｙｓ．化学。 C 114、6426–6432 (2010)。

CAS Google スカラー

Liu, S. et al. グラファイト、酸化グラファイト、酸化グラフェン、還元酸化グラフェンの抗菌活性: 膜と酸化ストレス。 ACS Nano 5、6971–6980 (2011)。

CAS PubMed Google Scholar

Akhavan, O. & Ghaderi, E. 細菌に対するグラフェンおよび酸化グラフェンナノウォールの毒性。 ACS Nano 4、5731–5736 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

Xu, Y.、Sheng, K.、Li, C. & Shi, G. ワンステップの水熱プロセスによる自己組織化グラフェンハイドロゲル。 ACS Nano 4、4324–4330 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

Thauer, RK、Jungermann, K. & Decker, K. 化学栄養性嫌気性細菌のエネルギー保存。バクテリオール。改訂 41、100–180 (1977)。

CAS PubMed Google Scholar

Kong、B.-S.、Geng、J.、Jung、H.-T. 真空濾過と金イオンの自然還元によるグラフェンと金のナノ粒子の層ごとの集合。化学。共通。 16、2174–2176 (2009)。

Google スカラー

Michaelidou, U. et al. 微生物群集と微生物燃料電池におけるチタンベースの陽極電極の電気化学的性能。応用環境。微生物。 77、1069–1075 (2011)。

CAS PubMed Google Scholar

ボロール、AP 他。エンジニアリング設計の改善と体外電子濃縮プロセスを統合して、微生物燃料電池からの出力を増加させます。 J. パワーソース 191、520–527 (2009)。

ADS CAS Google Scholar

チェン、J.ら。酸化グラフェンは、絡み合ったり膜を撹乱したりすることにより、細菌性植物病原体や真菌の分生子に対して広範囲の抗菌活性を示します。ナノスケール 6、1879 ～ 1889 年 (2014)。

ADS CAS PubMed Google Scholar

グルナサン、S.、ハン、JW、デイエム、AA、エッパカヤラ、V.、キム、J.-H. 緑膿菌における酸化グラフェンおよび還元酸化グラフェンの酸化ストレス媒介抗菌活性。内部。 J. Nanomedicine 7、5901–5914 (2012)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perreault, F.、de Faria, AF、Nejati, S. & Elimelech, M. 酸化グラフェンナノシートの抗菌特性: なぜサイズが重要なのか。 ACS Nano 9、7226–7236 (2015)。

CAS PubMed Google Scholar

Carpio、IEM、Santos、CM、Wei、X. & Rodrigues、DF 細菌性浮遊細胞、バイオフィルムおよび哺乳動物細胞に対するポリマーと酸化グラフェン複合体の毒性。ナノスケール 4、4746–4756 (2012)。

ADS Google Scholar

上妻亜生ほか水田微生物燃料電池で開発されたアノード関連マイクロバイオームの比較メタゲノミクス。 PLoS One 8、e77443 (2013)。

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

彼、S.ら。メタン排出に関連する湿地の微生物群集構成と機能遺伝子レパートリーのパターン。 mBio 6、e00066–15 (2015)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミラー、C.ら。全長 16S アンプリコンのショートリードアセンブリにより、地表下の堆積物における細菌の多様性が明らかになります。 PloS One 8、e56018 (2013)。

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

イェーツ医学博士ら。微生物燃料電池における陽極細菌群集の集中的発達。 ISME J. 6、2002–2013 (2012)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, Y.、Xiao, L.、Jayamani, I.、He, Z. & Cupples, AM 安定同位体プロービングとイルミナシークエンシングを使用して、微生物燃料電池における炭素源と発電の影響を受ける細菌群集を特徴付ける新しい方法。Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．メソッド 108、4–11 (2015)。

CAS PubMed Google Scholar

Lesnik, KL & Liu, H. 酢酸塩を供給する微生物燃料電池におけるコアマイクロバイオームの確立。応用微生物。バイオテクノロジー。 98、4187–4196 (2014)。

CAS PubMed Google Scholar

Malvankar, N. et al. 混合種バイオフィルムの電気伝導度。応用環境。微生物。 78、5967–5971 (2012)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lovley, DR、Fraga, JL、Coates, JD & Blunt-Harris, EL 嫌気呼吸用の電子供与体としての Humics。環境。微生物。 1、89–98 (1999)。

CAS PubMed Google Scholar

Byrne-Bailey, KG & Coates, JD 嫌気性過塩素酸塩還元細菌 Azospira suillum PS 株の完全なゲノム配列。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 194、2767–2768 (2012)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

シュトルツ、JF et al. 注: Sulfurospirillum barnesii sp. 11月およびスルフロスピリルム・アルセノフィラム・ｓｐ． 11 月、ε-プロテオバクテリアのスルフロスピリルムクレードの新しいメンバー。内部。Ｊ．Ｓｙｓｔ．バクテリオール。 49、1177–1180 (1999)。

CAS PubMed Google Scholar

Lanthier, M.、Gregory, KB & Lovley, DR Shewanella oneidensis 燃料電池における高浮遊生物量による成長。 FEMS 微生物。レット。 278、29–35 (2008)。

CAS PubMed Google Scholar

マルシリ、E. et al. シュワネラは、細胞外電子伝達を媒介するフラビンを分泌します。手順国立アカド。科学。 USA 105、3968–3973 (2008)。

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

吉田直人、井口宏、百合本博、村上明、酒井裕、メタノトローフ生物のニッチとしての水生植物の表面。フロント。微生物。 5、30 (2014)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

吉田 N.、Ye, L.、Liu, F.、Li, Z. & Katayama, A. デハロバクター種によるフサリドの還元的脱塩素化のための固体水素供与体としての生分解性プラスチックの評価。バイオリソース。テクノロジー。 130、478–485 (2013)。

CAS PubMed Google Scholar

吉田直人、藤井裕子、平石明。代謝活性のあるグラム陽性菌とグラム陰性菌を区別して検出するための改良型シアノジトリルテトラゾリウム還元法。微生物環境。 21、272–277 (2006)。

Google スカラー

リファレンスをダウンロードする

本研究は、JSPS科研費若手研究(A)（課題番号：26701010）の助成を受けました。在職期間追跡システム普及プログラム、文部科学省、日本。およびJST大学知財活用加速プログラム。

名古屋工業大学若手研究者育成センター（〒466-8555 愛知県名古屋市）

Naoko Yoshida

豊橋技術科学大学エレクトロニクス学際研究機構 (EIIRIS)、〒441-8580 愛知県豊橋市

Naoko Yoshida, Yuko Goto, Ryugo Tero & Akira Hiraishi

名古屋市産業試験場、名古屋市、456-0058、愛知県

Yasushi Miyata

名古屋工業大学土木工学科（〒466-8555 愛知県名古屋市）

Kasumi Doi

中部大学生命健康科学部生命医科学科、〒487-8501 愛知県春日井市

Yuko Goto

豊橋技術科学大学環境生命科学科、〒441-8580 愛知県豊橋市

Yuji Nagao, Ryugo Tero & Akira Hiraishi

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

ニューヨークは研究を計画し、原稿を書き、rGO-GORB複合体の濃縮、調製、電気化学的培養の実験を実施した。 YNとYGは濃縮実験に参加した。 KD は R4 株の電気化学的培養に参加しました。 RT は GO と rGO の分析を実施し、原稿の改訂に参加しました。 YMはCVとEISの実験を行いました。 AH はデータ解釈に参加し、原稿を修正しました。

競合する経済的利益が存在します。現在、論文で報告された手法について特許を申請中です。

この作品は、クリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされています。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、クレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材がクリエイティブコモンズライセンスに含まれていない場合、ユーザーは素材を複製するためにライセンス所有者から許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

吉田直人、宮田裕也、土居和也、他酸化グラフェンに依存した成長と自己凝集による外部起電力性細菌のヒドロゲル複合体への反応。 Sci Rep 6、21867 (2016)。 https://doi.org/10.1038/srep21867

引用をダウンロード

受信日: 2015 年 10 月 9 日

受理日: 2016 年 2 月 2 日

公開日: 2016 年 2 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21867

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

材料科学のフロンティア (2023)

ナノバイオテクノロジージャーナル (2021)

環境科学と公害研究 (2021)

生分解 (2020)

微生物学ジャーナル (2018)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。